摘要: 药物非临床生殖毒性试验多选用大鼠、家兔和食蟹猴等哺乳动物，而动物妊娠是目前影响非临床生殖毒性试验的关键环节，本文主要针对动物妊娠环节中存在的难点及应对方法进行讨论。大鼠可应用于生育力评估与早期胚胎发育毒性试验（Ⅰ段）、胚胎-胎仔发育毒性试验（Ⅱ段）和围产期毒性试验（Ⅲ段），可以通过阴道涂片法确定雌性大鼠的动情周期。在雌、雄大鼠按1∶1比例合笼过夜后，次日通过阴道栓检查来确认大鼠是否发生交配行为。家兔一般应用于胚胎-胎仔发育毒性试验（Ⅱ段），可通过观察雄性家兔和处于发情期的雌性家兔合笼后是否发生交配行为来确定受孕时间。家兔在生殖毒性动物试验中常出现雌兔发情不典型、不同批次间家兔发情情况差异显著、交配失败等问题，可通过延长光照时间、增加蛋白质摄入、选择合适的交配方式、改变饲养环境（雌兔和雄兔邻近饲养）等方式改善。非人灵长类动物一般应用于围产期毒性试验（Ⅲ段），准确判断雄性非人灵长类动物是否性成熟是其药物非临床生殖毒性试验的难点之一，可通过综合评估动物年龄、体重和睾丸体积等指标来判断它们是否性成熟。一般雄性猕猴年龄在4.5岁以上，体重大于4.5 kg，单侧睾丸体积超过10 mL，双侧睾丸总体积大于20 mL则表示性成熟。关于雌性非人灵长类动物是否妊娠，可通过超声检查是否能观察到明显孕囊进行判定，但这需要经验丰富的临床兽医制定完善的B超检查方法。综上所述，在非临床生殖毒性动物研究中，应根据不同种属动物的生殖系统解剖学特性，选择适合的检测/观察方法和结果判定标准，以确保动物成功交配，使非临床生殖毒性试验顺利开展。

摘要: 目的 开发α-1,3半乳糖苷转移酶基因敲除（α-1,3-galactosyltransferase gene-knockout,GTKO）/人CD55(human CD55 ,hCD55)转基因的基因编辑异种器官移植供体猪并进行功能验证。方法 利用成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）/CRISPR相关蛋白核酸酶9(CRISPR-associated nuclease 9,Cas9)、PiggyBac转座子技术和体细胞克隆技术，构建GTKO/hCD55基因编辑的滇南小耳猪，通过Sanger测序、实时荧光定量PCR、流式细胞术、免疫荧光实验、重亚硫酸盐测序、抗原抗体结合实验和补体依赖的细胞毒性实验分析其表型及功能。结果 将基因编辑载体PX458和PiggyBac转染至野生型胎猪成纤维细胞后，经嘌呤霉素药物筛选获得48个单细胞克隆，挑选2个单细胞克隆进行体细胞克隆，获得2个妊娠33 d的胎猪。F01胎猪的α-1,3-半乳糖基转移酶（α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1）基因型为-17 bp和野生型（wild type,WT）,F02胎猪的GGTA1基因型为-26 bp/+2 bp和-3 bp。两个胎猪的hCD55 mRNA表达量均显著高于WT猪（P<0.01），以F02胎猪作为供体细胞来源进行连续克隆后获得11头存活仔猪，鉴定均为GTKO/hCD55基因编辑猪。这些猪的α-Gal抗原表达缺失，但hCD55出现弱表达或不表达的情况。因此，对hCD55基因的CpG岛进行甲基化分析，结果表明在不表达hCD55的肾脏组织中h CD55基因的CpG岛被高甲基化，而表达hCD55的肾脏组织中hCD55基因的CpG岛未被甲基化或部分被甲基化。对h CD55基因的CpG岛进行密码子优化降低CG含量后，可实现hCD55基因的稳定表达。此外，抗原抗体结合实验表明人IgM结合到GTKO/hCD55基因编辑猪成纤维细胞的数量显著小于WT猪（P<0.01）；补体依赖的细胞毒性实验表明GTKO/hCD55猪的成纤维细胞成活率明显高于WT猪（P<0.01）。结论 成功获得了GTKO/hCD55基因编辑异种器官移植供体猪，并通过密码子优化降低了hCD55基因CpG岛的CG含量，从而有效避免甲基化导致的基因表达沉默。本研究可为供体猪的开发提供借鉴，将指导后续异种器官移植研究。

摘要: 目的 针对传统实验动物中心管理中存在的笼位调度效率低、人员行为监管不到位、设备老化难升级等问题，通过应用多模态大模型技术升级现有实验动物中心的信息系统，实现实验动物笼位状态的实时感知、实验人员行为的智能监管以及业务流程的自动化处理，从而提升管理效率与精细化水平。方法 浙江大学医学院附属第一医院实验动物中心提出一个基于人工智能的实验动物中心信息化升级方式，能兼容不同饲养设备。该系统架构自下而上依次包括硬件设施层、核心算法层和应用功能层。硬件设施层配备摄像头和高速网络传输设备，用于笼位和人员信息采集；核心算法层通过多阶段图像预处理技术和多模态大模型识别技术，实现图片信息抽取和识别；应用功能层将识别结果和已有动物中心信息相整合，生成实时笼位占有热力图，直观、清晰地展示实验动物中心的笼位使用密度分布情况。结果 基于人工智能的管理系统笼位识别准确率达98.5%，人员的实验服正确穿戴识别率为98.8%。每张图片平均处理时间约为3.7 s，笼位有效使用率提升23%，周转效率提高35%。此外，管理系统能够实时追踪并警告不规范行为，在通过智能化识别后，综合违规行为的发现次数暴露更多，违规行为发现率提升90.6%，持续使用3个月后，周平均违规行为较基线期下降54.0%。结论 将多模态大模型应用于实验动物管理领域，可实现笼位标识实时监控与自动化管理，提升管理效率和精确度。系统整合视觉识别和行为分析等多源数据，可构建对实验人员的全方位智能监管体系，为科研机构提供高效、精准、价廉的管理工具，推动实验动物管理的智能化发展。

摘要: 目的 构建脑海马区表达人源三突变淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）的阿尔茨海默病（Alzheimer's disease,AD）大鼠模型，为疾病机制和药物研究奠定基础。方法 将24只12周龄SPF级雌性SD大鼠随机分成空白对照组、空载病毒组和实验组，每组8只；其中，实验组通过脑立体定位在海马区注射携带人源三突变APP和NanoLuc萤光素酶基因的腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）进行造模。采用活体成像法观察各组大鼠脑内的病毒表达情况，新事物识别实验检测各组大鼠的认知记忆能力，实时荧光定量PCR检测APP基因表达水平，HE染色观察脑组织病理，采用尼氏染色观察海马区病变情况，用免疫组织化学检测β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein,Aβ）沉积情况。结果 活体成像显示实验组与空载病毒组大鼠脑部均检测到报告荧光。新事物识别实验发现实验组大鼠的认知记忆能力比对照组显著下降（P<0.01）。荧光定量PCR显示APP基因在实验组大鼠脑内表达水平显著增高（P<0.01）。重组AAV感染大鼠6个月后，脑组织HE染色和尼氏染色显示，实验组大鼠海马体CA1区神经元细胞和尼氏体数量减少而且排列混乱；免疫组织化学检测实验组大鼠海马CA1区及锥形细胞层可以看到明显的棕褐色沉淀，提示产生了Aβ沉积。结论 通过脑立体定位技术联合AAV转入人源三突变APP基因成功构建的大鼠模型可体现出典型AD特征，该模型可为基于Aβ沉积的AD病理研究和药物治疗研究提供动物模型并奠定基础。

摘要: 目的 通过原核表达和纯化得到树鼩Vasorin(VASN)重组蛋白，以此蛋白免疫小鼠制备抗树鼩VASN单克隆抗体，并初步评估其应用价值。方法 采用反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）法体外扩增树鼩VASN基因全长序列，将树鼩VASN基因片段插入到p ET-30a载体中，构建pET-30a-VASN重组质粒，用Bam HⅠ和SalⅠ对重组质粒进行双酶切鉴定，并通过测序进一步鉴定其正确性；将测序正确的重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中，利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-Dthiogalactoside,IPTG）诱导表达重组蛋白VASN；通过SDS-PAGE分离蛋白VASN，并利用KCl纯化重组蛋白VASN；用纯化的重组蛋白VASN对BALB/c小鼠进行4次免疫，并通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测小鼠血清抗体效价；取血清抗体效价达到1∶10 000以上的小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，先利用含黄嘌呤、氨基蝶呤及胸腺嘧啶核苷（hypoxanthine-aminopterin-thymidine,HAT）的培养基筛选杂交瘤细胞，随后通过ELISA筛选出能够分泌特异性抗体的阳性杂交瘤细胞株，并通过有限稀释法进行亚克隆，获得单克隆杂交瘤细胞株；通过腹水诱生法制备大量VASN单克隆抗体，利用rProtein G纯化抗体，采用ELISA和蛋白质印迹法检测单克隆抗体的结合常数和体外反应的特异性。结果 成功扩增出树鼩VASN基因并构建了树鼩pET-30a-VASN重组质粒，重组质粒经测序得到的序列与树鼩VASN目的基因序列完全一致；重组蛋白VASN主要以包涵体的形式存在，纯化后的蛋白纯度达到90%，符合后续免疫实验的要求；利用重组蛋白VASN 4次免疫小鼠后，小鼠血清抗体效价达1∶729 000；利用杂交瘤技术及有限稀释法获得单克隆阳性杂交瘤细胞株，通过腹水诱生和纯化得到单克隆抗体，ELISA测定单克隆抗体的结合常数值达2.59×10～7 L/mol；蛋白质印迹法结果显示，树鼩VASN单克隆抗体能与树鼩VASN重组蛋白结合，与猪视黄醇结合蛋白4重组蛋白、人源VASN-富含亮氨酸重复序列重组蛋白以及牛血清白蛋白均无结合反应；而抗树鼩VASN单克隆抗体能特异性识别树鼩心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肌肉组织中的VASN蛋白，且条带明显、背景清晰。免疫组织化学检测结果显示，该单克隆抗体可以识别蛋白VASN mRNA表达水平较高的树鼩脾脏、肺脏和树鼩永生化成纤维细胞中的VASN蛋白。结论 成功制备了抗树鼩VASN的单克隆抗体，该抗体可用于树鼩永生化成纤维细胞、树鼩脾脏组织和肺脏组织的免疫组织化学检测，为进一步探索VASN在树鼩模型中的功能提供了重要的工具。

摘要: 目的 观察比较不同浓度环磷酰胺（cyclophosphamide, CTX）诱导小鼠早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency,POI）模型的效果并探讨损伤机制。方法 32只6～8周龄的C57BL/6J雌性小鼠按体重随机区组法分为4组，每组8只，分别用75 mg/kg CTX、120 mg/kg CTX、120 mg/kg CTX+12 mg/kg白消安（Busulfan）和同体积生理盐水腹腔单次注射来建立POI模型，测定每组小鼠的卵巢系数、血清中雌二醇（estradiol,E₂）和卵泡刺激素（follicle stimulating hormone,FSH）水平，并通过蛋白质印迹法检测不同造模浓度条件下卵巢组织内NAD依赖性蛋白脱酰酶5（NAD-dependent deacetylase sirtuin-5,SIRT5）和叉头框蛋白O3a（forkhead box protein O3a,FOXO3a）蛋白表达水平的变化规律。筛选最佳造模浓度后，将40只6～8周龄的C57BL/6J雌性小鼠按体重随机区组法分为5组，每组8只；以生理盐水作为对照，用120 mg/kg CTX造模后第1、2、7、14天，通过蛋白质印迹法检测不同造模时间内卵巢组织中SIRT5和FOXO3a蛋白表达水平的变化规律。结果 与生理盐水对照组比较，不同浓度的CTX（75 mg/kg和120 mg/kg）和120 mg/kg CTX+12 mg/kg Busulfan均可以诱导小鼠出现POI损伤，其中120 mg/kg CTX造模小鼠的卵巢系数（P<0.001）和E₂水平变化较小（P<0.05）,120 mg/kg CTX+12 mg/kg Busulfan组小鼠被毛粗糙，光泽度下降，反应迟钝，状态最差。与生理盐水对照组相比，75 mg/kg CTX造模组小鼠的卵巢组织中FOXO3a表达显著下调（P<0.05）,SIRT5表达没有显著变化（P>0.05），而120 mg/kg CTX造模组的SIRT5（P<0.05）和FOXO3a（P<0.05）表达均显著下调。120 mg/kg CTX造模后第2和7天，SIRT5（P<0.01）和FOXO3a（P<0.001）表达均显著下调，且第7天时表达水平变化最大（SIRT5,P<0.000 1;FOXO3a,P<0.000 1）。结论 120 mg/kg CTX诱导小鼠POI模型的卵巢损伤小于75 mg/kg CTX诱导的POI模型，并且120 mg/kg CTX造模第7天的SIRT5和FOXO3a表达变化最为显著，其作用机制可能与SIRT5-FOXO3a通路活性受抑制相关。

摘要: 目的 椎体成形术全称为经皮穿刺椎体成形术（percutaneous vertebroplasty,PVP），是临床上向病变椎体内注入骨水泥以达到强化椎体的技术。骨水泥的安全性和有效性研究是其临床应用的基础，本研究采用椎体成形术来评价和比较实验猪体内Tecres和不透射线骨水泥的安全性和有效性，并确定适合猪的穿刺方法以及临床前评价骨水泥安全性和有效性的方法。方法 将24头实验用猪（体重60～80 kg）随机分为试验组（A组）和对照组（B组）：A组为Tecres骨水泥组，B组为不透射线骨水泥组，每组12头。在C型臂X射线机的监视下，采用单侧椎弓根入路法经皮穿刺将Tecres骨水泥或不透射线骨水泥植入到猪的第1腰椎（L1）和第4腰椎（L4）中，分别于术后在4周和在26周采用安乐死的方法处死动物，取其L4椎体进行抗压强度测试，取其L1椎体进行硬组织病理学检查，观察植入部位的炎症反应、骨坏死情况以及骨整合程度。结果 在骨水泥植入术后第4周和第26周时，A、B两组之间椎体抗压强度的测试结果均无显著差异（P>0.05）。光学显微镜下的（×100）观察结果显示，术后第4周时，A、B两组均可见骨水泥被增生的纤维组织包裹，周边有淋巴细胞浸润，骨水泥与骨组织结合，骨小梁排列紊乱，成骨细胞及少量类骨质形成。术后第26周时，A、B两组均可见骨水泥，以及新生骨组织矿化、骨小梁融合、骨小梁结构规整致密且连续性好，未见明显的炎症反应。结论 在实验猪椎骨内，Tecres和不透射线骨水泥的抗压强度、引起的炎症反应、对骨的破坏以及与骨的整合程度均未见明显差异，均具有良好的生物相容性和成骨特性，表明用椎体成形术在猪体内评价骨水泥的安全性和有效性是科学的。

摘要: 随着国内实验动物行业的飞速发展，动物实验成为高校科研成果产出和课堂教学的重要辅助手段，实验动物从业人员队伍也日益壮大。虽然近年来国家开始重视实验动物从业人员职业健康，并出台了相关的法规政策，但是现阶段高校针对实验动物从业人员的职业健康风险防控还处于薄弱环节。因此，笔者围绕高校实验动物研究中心管理规范，通过走访、座谈以及学术交流，对国内9家普通高校实验动物从业人员的职业健康管理与防护现状进行了深入调研，揭示了高校实验动物从业人员面临的5大职业健康风险，包括实验动物过敏症、人兽共患传染病、机械性损伤、化学性刺激以及心理因素，指出当前高校普遍存在管理体系不健全、风险评估机制缺失和防护设施不足等核心问题。针对上述问题，本研究提出了三级防控体系：在高校层面，需健全制度并加大经费投入；在实验动物中心层面，应建立动物生物安全实验室，并强化危险源管控、应急预案演练与健康监护；在实验动物从业人员层面，需规范防护装备使用，参与职业健康培训，严格执行安全操作规程，及时上报职业暴露事件。在多方协作的基础上，笔者尝试分析并探讨构建国内普通高校科学、高效的职业健康保障体系的可行路径，以期为实验动物行业的可持续发展提供理论支撑与实践参考。

摘要: 非人灵长类因其与人类在遗传学和生理学上的高度相似性，成为生命科学研究和生物医药开发的关键性实验动物，不仅为神经系统疾病和传染病的机制研究提供理想平台，还被广泛用于大分子药物的临床前安全性评估，被誉为“金标准”。然而，这种生物学相似性也导致从业人员因接触非人灵长类实验动物或其组织、体液而面临较高的人兽共患病传播风险。结合近年来国内外人兽共患病暴发情况及国家生物安全法颁布实施的背景，本文综述了非人灵长类实验动物从业人员面临的职业风险因素（包括生物因素、化学因素、物理因素）、常见的人兽共患病及其病原体分类、传播途径、危害程度，以及从业人员职业危害暴露的处理方式，进而提出建立多维防控体系：(1)风险评估与应急处理，即通过职业健康安全委员会（Occupational Health and Safety Committee,OHSC）定期识别危险源，制定暴露后紧急处理流程；（2）管理体系优化，即完善设施设计、个人防护装备配置，并强化从业人员健康监护与疫苗接种；（3）技术培训与规范操作，即开展非人灵长类实验动物行为学、生物安全操作等专项培训，推广智能监控技术以减少攻击性事件等措施。本文旨在提高非人灵长类实验动物从业人员的健康安全意识，加强人员个人防护及专业技能操作的规范性指引，从而保障从业人员健康安全，降低职业暴露率，有效预防实验动物相关职业病。

摘要: 实验动物机构建立职业健康安全管理体系中重要的一环是建立职业健康档案。此档案是保障实验动物从业人员合法权益的重要环节，也是对实验动物机构本身的保护。依据相关法律法规，实验动物机构有责任为从业机构及实验动物从业人员建立职业健康（也称职业卫生）监护档案并妥善保存。依据《职业卫生档案管理规范》，实验动物机构至少要建立7个职业健康档案盒：建设项目职业健康“三同时”档案，职业健康管理档案，职业健康宣传培训档案，职业病危害因素监测与检测评价档案，用人单位职业健康监护管理档案，从业人员个人职业健康监护档案，以及其他档案。在此基础上，《工作场所职业卫生监督管理规定》又细化了职业健康档案的要求及细节，包括：职业病防治责任制文件；职业卫生管理规章制度、操作规程；工作场所职业病危害因素种类清单、岗位分布及作业人员接触情况等资料；职业病防护设施、应急救援设施基本信息，以及其配置、使用、维护、检修与更换等记录；职业病防护用品配备、发放、维护与更换等记录；职业病危害事故报告与应急处置记录等12项要求。总之，职业健康档案包含了一系列与从业人员职业健康相关的资料和信息，是一个综合性的档案。基于作者的实践经验，本文简述了职业健康档案的主要类型及每个类型的基本内容及建设要点，并对怎样建立职业健康档案进行了详细解析，以期帮助实验动物机构顺利建立职业健康管理档案，完善机构的职业健康安全管理体系。