摘要: 核因子E2相关因子2(Nrf2)-Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)信号通路可调控抗氧化酶和代谢酶基因的表达,在机体适应氧化和化学胁迫过程中具有重要作用,克隆二化螟Chilo suppressalis CsCncC和CsKeap1基因可为研究二化螟的代谢抗性机制奠定基础。本研究采用RT-PCR和RACE技术克隆了二化螟CsCncC和CsKeap1基因全长cDNA,利用生物信息学方法对其结构特征进行了分析,并利用实时定量PCR检测了基因表达模式。结果表明,CsCncC包含一个长度为2 160 bp的开放阅读框,编码719个氨基酸;CsKeap1包含一个长度为1 923 bp的开放阅读框,编码640个氨基酸。序列分析发现,CsCncC和CsKeap1都具有保守性结构域和特征性基序。表达分析发现,CsCncC和CsKeap1分别在蛹末期和成虫初期表达水平最高,CsCncC在中肠和马氏管中的表达水平最高,CsKeap1在脂肪体中的表达水平最高。进一步研究发现,在0.47 mg/L氯虫苯甲酰胺处理36 h后,二化螟3龄幼虫的CsCncC和CsKeap1的表达量显著上调,但在0.092 mg/L处理36 h后CsCncC无明显变化,CsKeap1的表达量显著下调,表明诱导效应具有剂量依赖性。本文研究结果表明,CsCncC和CsKeap1参与的信号通路在二化螟适应化学胁迫过程中具有重要作用。

摘要: 核糖体蛋白(ribosomal protein, Rp)是一类参与蛋白质合成、细胞代谢、机体免疫及信号传导等重要功能的蛋白质。本研究旨在克隆沙葱萤叶甲Galeruca daurica核糖体蛋白S3a基因cDNA全长序列,分析其分子特性和表达模式,以期为进一步研究其在沙葱萤叶甲生长发育及滞育中的作用提供必要的基础。根据现有的沙葱萤叶甲转录组测序数据,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得了沙葱萤叶甲RpS3a基因的全长cDNA序列,命名为GdRpS3a(GenBank登录号:MN660144)。该基因全长为800 bp,开放阅读框全长为687 bp,编码228个氨基酸,具有核糖体蛋白S3a家族的保守功能域;预测分子量为25.63 kDa,等电点pI为10.53,无信号肽和跨膜结构。同源序列比对和系统发育分析表明,GdRpS3a与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera RpS3a的亲缘关系最近,其氨基酸序列一致性最高为54.10%。采用qPCR技术检测该基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段(卵、1～3龄幼虫、预蛹、蛹及成虫羽化3、7、10、15、25、40、60、80和100 d)和3日龄成虫在不同温度(0、5、10、15、20、25、30、35和40℃)处理1 h后的表达谱。结果表明:GdRpS3a在不同发育阶段的沙葱萤叶甲体内均有表达,在成虫滞育结束后表达量最高,在卵期和成虫滞育期间低表达。温度对GdRpS3a的表达有显著的影响,30℃下最高,0℃下最低。GdRps3a的表达与沙葱萤叶甲生长发育阶段及环境温度有关,可能在沙葱萤叶甲成虫夏滞育中起着重要作用。

摘要: 研究通过克隆翘嘴鲌(Culter alburnus)血红蛋白基因,分析血红蛋白的分子特征及系统进化,探讨鱼类耐低氧的可能成因。研究克隆了翘嘴鲌血红蛋白家族中Hba1/2和Hbb1/2 cDNA序列,翻译后分别得到143、143、147和147个氨基酸。蛋白二级结构分析表明Hba1/2和Hbb1/2蛋白分别包含7和8个螺旋域、14和13个α1β2结合残基、12和16个亚铁血红素结合残基,均有16个α1β1结合残基,只有Hba1/2蛋白具有6个Bohr效应残基。与两栖类和哺乳类相比,鱼类Hba和Hbb蛋白功能域上分别有10和5个氨基酸残基替换位点,这很可能是为了使其适应水中的低氧环境。而耐低氧与不耐低氧鱼类相比,其蛋白二级结构并未发现一致性的替换,这表明鱼类的耐低氧特征很可能是受到上游信号通路的调控。通过系统发育关系表明Hba1/2和Hbb1/2基因亚型的复制事件很可能发生在脊椎动物全基因组复制之后且硬骨鱼类全基因组复制事件之前。值得注意的是在系统进化树上,与其他鱼类相比翘嘴鲌和斑马鱼在Hba1/2和Hbb1基因上有更近的亲缘关系,这很可能是由于其同属鲤形目且均不耐低氧所致。研究首次克隆了翘嘴鲌血红蛋白家族基因,分析其分子特征及与其他物种的系统发育关系,并探讨了鱼类耐低氧的可能成因,为鱼类的耐低氧生物学研究提供了理论基础与潜在方向。

摘要: spindlin基因是减数分裂纺锤体相关因子,为了研究spindlin基因在二倍体和三倍体雌性虹鳟减数分裂过程中出现的差异,通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得spindlin基因cDNA 4529 bp(GenBank登录号:MN378564),其中3′非编码区(UTR)和5′非编码区(UTR)分别长3662 bp和141 bp,开放阅读框(ORF)长726 bp,编码241个氨基酸,该蛋白质序列的相对分子量为28.3 kD,理论等电点值为5.94,无跨膜结构。同源性分析表明,虹鳟(Oncorhynchus mykiss)与银大马哈鱼(Oncorhynchus kisutch)同源最高,高达99.59%。系统发育进化树显示,虹鳟与大鳞大马哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)和红点鲑(Salvelinus alpinus),聚为一支。实时荧光定量(RT-PCR)结果显示, spindlin基因在二倍体雌性虹鳟卵巢、肾、肝、脾、肌、鳃、心、眼、肠和鳍组织中均有表达,其中,在卵巢中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01)。对于二倍体雌性虹鳟,在受精后240—300d(days post fertilization, dpf)发育阶段, spindlin基因在卵巢组织中的相对表达量显著下降。对于三倍体雌性虹鳟,该基因在240—330 dpf阶段的表达量显著上升。在同一发育阶段中, spindlin基因在二倍体雌性虹鳟卵巢中的表达量较三倍体雌性虹鳟相对较高,且均存在极显著差异(P<0.01)。通过免疫组化结果发现,二倍体雌性虹鳟在240 dpf阶段, Spin蛋白在初级卵母细胞核内信号最强,在270—330 dpf阶段逐渐减弱;三倍体虹鳟卵巢在240—330 dpf发育阶段,在卵原细胞中信号逐渐增强。减数分裂异常是性腺败育的关键原因,研究结果表明三倍体虹鳟在减数分裂过程中出现异常与spindlin基因的低表达有关,这可能是卵巢发育阻滞的原因之一。

摘要: 嗅觉系统在蚊虫追寻宿主、寻找配偶、选择产卵场所等行为中起着重要的作用,气味结合蛋白与气味分子结合是昆虫嗅觉识别的第一步生化反应.为研究中华按蚊气味结合蛋白在追寻宿主中的作用,通过反转录PCR(RT-PCR)克隆气味结合蛋白62(odorant binding protein 62,AsinOBP62)基因,利用定量PCR分析AsinOBP62在不同组织(触角、喙、下颚须及头胸腹部)、不同发育时期(蛹期、羽化1 d、3 d)和吸血前后的表达水平,通过荧光竞争结合实验测定AsinOBP62蛋白与16种人体气味物质和2种趋避剂的结合能力.结果显示,AsinOBP62基因开放阅读框长507 bp,编码168个氨基酸,具有气味结合蛋白典型的6个保守半胱氨酸残基,属于Classic亚家族成员.定量PCR结果显示,AsinOBP62主要在成蚊触角中表达,羽化后AsinOBP62的表达水平逐渐增强.吸食血液后,AsinOBP62的表达水平显著下降.荧光竞争结合实验显示,在测定的18种气味物质中,AsinOBP62与12种化合物具有结合活性,表明AsinOBP62对人体挥发物具有明显的选择性.其中,与2-甲基吡啶结合能力最强,解离常数K_i=34.34μmol/L.根据AsinOBP62基因的表达特点和重组蛋白的结合特性,推断AsinOBP62基因可能在雌蚊追寻宿主的过程中起着重要的作用.(图6表2参51)