摘要: 【目的】昆虫的气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)与嗅觉识别密切相关,在触角感受器淋巴液内运输外界的脂溶性气味分子顺利到达嗅觉受体过程中起着关键的作用。本研究对柑橘大实蝇Bactrocera minax的气味结合蛋白基因进行了克隆和表达分析,旨在更好地了解气味结合蛋白在柑橘大实蝇嗅觉识别中的作用及为进一步研究柑橘大实蝇嗅觉传递的分子机制奠定基础。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆柑橘大实蝇的气味结合蛋白基因,并进行生物信息学分析;构建重组表达载体p ET28a(+)-Bmin OBP25,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中,SDS-PAGE及Western blotting鉴定重组表达蛋白;采用荧光定量PCR检测该基因在柑橘大实蝇成虫不同组织中的表达。【结果】克隆获得柑橘大实蝇气味结合蛋白基因的c DNA全长序列,命名为Bmin OBP25(Gen Bank登录号:MH181875)。测序结果表明,Bmin OBP25开放阅读框全长447 bp,编码148个氨基酸,预测分子量为17.5 k D,编码序列具有OBPs典型的6个保守半胱氨酸和6个α螺旋区域特征。在IPTG诱导下目标蛋白以6×His标签融合蛋白的形式在宿主菌中得到稳定表达。荧光定量PCR分析表明,Bmin OBP25 mRNA在成虫触角、头(去除触角)、胸、腹、足、翅和产卵器中均有表达,其中在触角、头(去除触角)、足和产卵器中表达量较高。【结论】Bmin OBP25在柑橘大实蝇成虫触角、头、足和产卵器中具有高转录活性,提示该基因在非嗅觉组织中可能也具有生理功能,特别是可能在昆虫的取食与产卵地选择过程中起重要作用,其功能还需深入研究。本研究实现了Bmin OBP25基因的原核表达,为深入研究Bmin OBP25基因的功能奠定基础。

摘要: 【目的】本研究旨在明确中华蜜蜂Apis cerana cerana半乳糖凝集素(galectin)的功能及其与病毒的相互作用。【方法】提取中华蜜蜂的总RNA,利用RT-PCR技术获得Galectin基因,然后利用生物信息学软件对基因序列及其推导氨基酸序列和结构特征进行分析;再依据大肠杆菌Escherichia coli密码子的偏嗜性对该基因密码子进行优化、原核表达,并制备重组蛋白;最后,通过Far-western blotting技术检测纯化的重组蛋白与纯化的中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)、慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)和残翅病毒(Deformed wing virus,DWV)的结合情况。【结果】从中华蜜蜂中克隆到Galectin基因,并将其命名为Ac Galectin(Gen Bank登录号:MG557559),其cDNA全长为1 473 bp。Ac Galectin空间结构比较稳定,包含一个半乳糖识别结构域。系统进化树表明,Galectin明显分为两簇,膜翅目蜜蜂科昆虫的Galectin形成一个簇,而其他昆虫Galectin形成另一簇。经密码子优化后的Ac Galectin基因能够在大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中高效表达。纯化的重组Ac Galectin蛋白可与CSBV和CBPV结合,但不与DWV结合。【结论】结果表明Ac Galectin与蜂病毒CSBV和CBPV有结合作用。本研究为Ac Galectin在CSBV和CBPV感染过程中的功能研究奠定了基础。

摘要: 【目的】克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的组织蛋白酶L(cathepsin L,CatL)基因,分析该基因的序列特征并制备该酶多克隆抗体,为探析其生理功能奠定基础。【方法】根据甜菜夜蛾Spodoptera exigua的组织蛋白酶L基因开放阅读框(ORF)序列两端直接设计引物克隆草地贪夜蛾组织蛋白酶L基因。利用生物信息学软件分析该基因的序列特征,利用ClustalX2软件进行同源比对和进化分析,利用同源建模预测该酶三维结构。通过原核表达重组蛋白,多次免疫新西兰大白兔制备该酶多克隆抗体。【结果】克隆获得了草地贪夜蛾的组织蛋白酶L基因SfCatL(GenBank登录号:HQ110065),ORF序列长1 035 bp,编码344个氨基酸,预测N-末端含有长度为16个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽序列后,预测成熟蛋白分子量为36.8 kD,等电点为6.69。SfCatL氨基酸序列与其他13个物种的组织蛋白酶L氨基酸序列比较有53.7%96.8%的一致性,与甜菜夜蛾组织蛋白酶L氨基酸序列一致性最高,达96.8%。同源建模预测表明,SfCatL折叠成紧密而稳定的元宝状结构,含3个对结构有稳定作用的二硫键,亲水性氨基酸主要包被在蛋白的表面。原核表达、纯化SfCatL蛋白制备抗血清,其效价超过1∶40 000,Western blot鉴定结果表明抗血清与草地贪夜蛾Sf9细胞SfCatL蛋白能够特异性结合。【结论】获得了草地贪夜蛾SfCatL完整ORF序列,分析了其特征,经原核表达、纯化获得高纯度的融合蛋白,成功获得多克隆抗体。本研究为进一步研究该基因的功能并开发组织蛋白酶抑制剂类杀虫剂提供理论依据。

摘要: 【目的】克隆获得中华蜜蜂Apis cerana cerana转录因子AP-1(transcription factor AP-1)基因Acc AP-1序列,分析其在中华蜜蜂不同发育时期和组织中以及不同非生物应激条件下的表达差异,为该基因的功能研究提供参考。【方法】以中华蜜蜂全组织cDNA为模板,利用RT-PCR技术扩增克隆获得中华蜜蜂转录因子AP-1基因cDNA序列;利用生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;采用MEGA 5.2软件中的邻接法(neighbor-joining,NJ)构建中华蜜蜂转录因子AP-1与其他膜翅目昆虫同源AP-1蛋白系统发育树;通过实时定量PCR分析中华蜜蜂转录因子AP-1基因在不同发育时期(1-6日龄幼虫、预蛹、白眼蛹、红眼蛹、褐眼蛹、1日龄成年工蜂和15日龄成年工蜂)以及15日龄成年工蜂不同组织(头、肌肉、表皮、中肠、直肠和毒腺)中的mRNA表达情况;将15日龄成年工蜂分别置于极端温度(4℃,16℃和44℃)下,以及饲喂含有农药(0.01 mL/L百草枯)和重金属(1 mg/mL Cd Cl2)的蔗糖溶液条件下,分析目的基因mRNA的表达情况。【结果】克隆获得了中华蜜蜂转录因子AP-1基因Acc AP-1(GenBank登录号:MF994311)开放阅读框(ORF)的序列,其长度为813 bp,编码270个氨基酸,预测蛋白分子量为30.24 kD,理论等电点为8.31。保守结构域分析表明,在第7-137位氨基酸之间存在一个Jun超家族的保守结构域,在第195-255位氨基酸之间存在一个b ZIP_Jun超家族的保守结构域。氨基酸序列比对以及进化树结果显示,中华蜜蜂与西方蜜蜂Apis mellifera的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,Acc AP-1在各发育时期表达量差异显著(P<0.05),其中,在1日龄幼虫和15日龄成蜂期表达量最高;Acc AP-1在测试的各组织中均有表达,在肌肉中的表达量最高(P<0.05)。不同非生物应激条件下的表达量分析表明,4℃低温可以诱导Acc AP-1表达量显著升高(P<0.05),16℃处理0.52 h可显著提高其表达量(P<0.05),2 h后表达量逐渐降低,而44℃处理时除了在15 min时表达量显著下降(P<0.05),其余时间点表达量差异不显著(P>0.05);在饲喂含有百草枯的蔗糖溶液后,其表达量显著降低(P<0.05),而Cd Cl2处理诱导其表达量显著升高(P<0.05)。【结论】结果提示Acc AP-1基因可能参与中华蜜蜂机体抵抗外界环境压力的过程。

摘要: 【目的】海藻糖酶(trehalase,Tre)作为昆虫体内海藻糖代谢的关键性酶,在昆虫能量调节和生长发育中具有重要作用。本研究旨在克隆获得沙葱萤叶甲Galeruca daurica海藻糖酶基因,并对其表达模式进行定量分析,以期探究海藻糖酶在沙葱萤叶甲生长发育和成虫夏滞育中的作用。【方法】根据沙葱萤叶甲转录组数据,采用RACE技术,克隆得到Tre基因的c DNA全长,并进行生物信息学分析;应用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)技术检测其在沙葱萤叶甲不同发育阶段[卵、1-3龄幼虫、预蛹、蛹、成虫(羽化后3,7,10,15,25,40,60,80和100 d)]、成虫不同组织(头、胸和腹)以及3日龄成虫在不同温度(15,20,25,30,35和40℃)胁迫下的表达水平;采用3,5-二硝基水杨酸法测定不同日龄成虫体内海藻糖酶活性。【结果】克隆获得了沙葱萤叶甲可溶性海藻糖酶基因,并命名为Gd Tre1(Gen Bank登录号:KY697913),该基因全长1 933 bp,开放阅读框1 704bp,编码567个氨基酸;蛋白预测分子量为66.56 k D,等电点为6.62;编码蛋白具有海藻糖酶超基因家族典型的功能结构域,包含1条信号肽,不具有跨膜结构。同源序列比对和系统发育分析表明,Gd Tre1与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata Tre1b的同源性最高,氨基酸序列一致性达70.25%。RT-q PCR检测结果表明,Gd Tre1在沙葱萤叶甲各发育阶段均有表达,其中在卵期和成虫滞育期间高表达,而在幼虫、预蛹、蛹及成虫滞育前低表达;在成虫不同组织中,通常在腹部中表达量最高,其次为胸部,最低为头部;Gd Tre1表达量随着温度升高而上升,30℃达最高值,而后随温度升高略有下降。沙葱萤叶甲不同日龄成虫体内Gd Tre1表达量及Tre活性存在显著差异,且Gd Tre1表达量与Tre活性变化趋势一致。【结论】海藻糖酶与沙葱萤叶甲生长发育和成虫夏滞育有密切的关系。该结果为进一步揭示该虫的夏滞育分子机理提供了必要的基础。