摘要: 【目的】Toll样受体是昆虫Toll信号传导途径的一个重要组成成员,对激活昆虫机体对入侵病原微生物的先天免疫应答起着至关重要的作用。本研究旨在探究脂多糖对家蚕Bombyx mori幼虫中Toll样受体基因BmToll9-2基因表达的影响。【方法】利用RT-PCR分析BmToll9-2基因在家蚕大造品系4龄和5龄幼虫表皮、脂肪体、马氏管、中肠、神经、丝腺、胸部肌肉共7种组织中的表达特征;将脂多糖和大肠杆菌Escherichia coli注射到5龄幼虫体腔内,诱导其免疫系统响应,采用实时荧光定量PCR分析注射后不同时间BmToll9-2基因在中肠中的表达水平。【结果】RT-PCR结果表明,BmToll9-2基因在家蚕4龄幼虫的脂肪体、马氏管、神经和丝腺中高度表达,在5龄幼虫脂肪体、中肠、马氏管和神经中均有较高表达。实时荧光定量PCR结果显示,注射脂多糖能诱导5龄幼虫中肠中BmToll9-2基因转录,在注射后6 h时的诱导效果最好;注射大肠杆菌也能诱导BmToll9-2基因转录,在注射后3和6 h时的诱导效果最好。【结论】家蚕幼虫BmToll9-2基因在脂多糖和大肠杆菌处理后上调表达,提示BmToll9-2受体可能参与昆虫Toll样受体对脂多糖和细菌的识别过程。

摘要: 【目的】探索荒漠昆虫小胸鳖甲Microdera punctipennis低温响应的分子机理并挖掘其耐寒基因。【方法】根据低温转录组数据筛选并克隆小胸鳖甲几丁质酶基因,并进行生物信息学分析;通过实时荧光定量PCR和免疫组织化学法分析该基因在成虫不同组织中和4℃低温胁迫下的表达模式分析。【结果】从小胸鳖甲成虫克隆获得一个几丁质酶基因Mpcht19(Gen Bank登录号:KY126382)。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白Mp CHT19属于Ⅳ型昆虫几丁质酶,理论分子量约为27.18 k D,无信号肽,具亲水性。系统进化分析表明,Mp CHT19与赤拟谷盗Tribolium castaneumⅣ型几丁质酶Tc CHT19同源性最高,氨基酸序列一致性为34.05%。实时荧光定量PCR结果显示,Mpcht19在成虫脂肪体和后肠中高表达,具有组织特异性;该基因的表达还受4℃低温诱导。免疫组织化学分析结果显示,在4℃低温下Mp CHT19蛋白在脂肪体和后肠中表达。【结论】Mpcht19基因的表达具有组织特异性,并受低温诱导。研究结果有助于深入研究几丁质酶与小胸鳖甲耐寒性的关系。

摘要: 【目的】miRNAs(microRNAs)是一类广泛存在于真核生物中并参与调控生物体多种生命活动的非编码RNA。昆虫蜕皮发育过程包括新表皮的生成和旧表皮的降解。本研究旨在鉴定靶向调控飞蝗表皮代谢关键基因的miRNAs,为研究飞蝗Locusta migratoria表皮发育的分子调控机制提供一定的实验基础,同时为研发新的害虫防治分子靶标和防治策略提供科学依据。【方法】采用生物信息学方法预测与飞蝗表皮代谢关键基因潜在结合的miRNAs;荧光定量PCR方法检测表皮代谢相关基因及以其为靶标的miRNAs在飞蝗2龄和3龄第1,3和5天若虫中的表达趋势;利用免疫共沉淀技术及双荧光素酶报告技术在体内外水平分析miRNA与其靶基因的结合情况。【结果】生物信息学方法预测到与脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-N-acetylglucosamine pyrophorylase,UAP)、糖基转移酶(asparagine-linked glycosylation protein 5,ALG5)和Sinuous等表皮代谢相关酶基因有潜在结合能力的miRNAs分别为miRNA-276b,miRNA-2796,miRNA-275和miRNA-184。荧光定量PCR分析表明,FAS,UAP,ALG5以及Sinuous在飞蝗2龄和3龄不同日龄若虫表皮中具有相似的表达趋势,FAS与以其为靶标的miRNA-276b表达趋势相同,其余3个基因与以其为靶标的miRNAs的表达趋势相反。通过体内免疫共沉淀研究发现,AGO1抗体可显著富集FAS,UAP,ALG5和Sinuous基因以及以其为靶标的miRNAs。体外双荧光素酶实验发现,miRNA-276b,miRNA-2796,miRNA-275和miRNA-184对表皮代谢基因FAS,UAP,ALG5和Sinuous的表达有较明显的抑制作用。【结论】本研究鉴定了靶向调控飞蝗表皮代谢基因FAS,UAP,ALG5和Sinuous的潜在miRNAs,为进一步研究表皮miRNAs对飞蝗蜕皮发育的调控机制及害虫防治新靶标的发现提供了重要科学依据。

摘要: 【目的】克隆棉蚜Aphis gossypii Glover溶菌酶基因并进行原核表达,分析其在不同日龄和不同寄主植物上棉蚜体内的表达特征,为进一步研究溶菌酶的功能及其与棉蚜共生菌间的关系奠定基础。【方法】以无翅棉蚜成虫总RNA为模板,采用RT-PCR与RACE方法获得棉蚜溶菌酶基因的cDNA全长序列;将信号肽序列剪切后的棉蚜溶菌酶基因片段连接到原核表达载体pET-30a,并转化到大肠杆菌Eschericha coli中进行诱导表达;采用定量PCR方法测定该基因在不同日龄(1-19日龄)以及西葫芦、黄瓜和豇豆等不同寄主植物上棉蚜体内的相对表达量。【结果】克隆获得棉蚜溶菌酶基因,命名为AgLYS(Gen Bank登录号:KY575341),cDNA全长为680 bp,开放阅读框为516bp,编码172个氨基酸残基。AgLYS的N-末端含有长度为36个氨基酸残基的信号肽序列。系统发育分析表明,棉蚜溶菌酶属于i型溶菌酶,并且与豌豆蚜Acyrthosiphon pisum i型溶菌酶基因的氨基酸序列一致性达90%。AgLYS可在大肠杆菌中诱导表达,表达蛋白分子量为20 k D左右。AgLYS在1-19日龄的棉蚜体内均有表达,但在1-9日龄棉蚜体内表达量较低,11日龄后的棉蚜体内表达量极显著升高(P<0.01)。同时,在西葫芦上饲养的棉蚜体内AgLYS的表达量极显著高于在黄瓜和豇豆上饲养的棉蚜体内的表达量(P<0.01)。【结论】从棉蚜中克隆获得了i型溶菌酶基因AgLYS,并在大肠杆菌中诱导表达。棉蚜AgLYS基因的表达量受蚜虫日龄及所取食寄主种类的影响,推测棉蚜i型溶菌酶AgLYS可能与棉蚜体内共生菌种群密度的调控相关。

摘要: 为了研究斑节对虾α-淀粉酶基因的结构和生物学功能,根据原实验室构建的斑节对虾(Penaeus monodon)c DNA文库得到的EST序列,利用RACE技术获得了斑节对虾α-淀粉酶基因(Pm Amy)的c DNA全长序列。该基因序列全长2465 bp,包括2175 bp的开放阅读框,编码724个氨基酸,分子总量为78.9 k D,理论等电点为4.66。Pm Amy包含一个α-淀粉酶家族保守的A结构域(Thr~(34)-Ser~(410))和一个C结构域(Glu~(420)-Ala~(496))。Pm Amy氨基酸序列与其他物种的相似性为47%—99%,利用Pm Amy构建的进化树显示斑节对虾和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的亲缘关系最近。基因表达结果显示Pm Amy在肝胰腺组织中的表达量显著高于其他组织(P<0.05)。斑节对虾Pm Amy基因在卵巢发育的过程中均有表达,表达量有所变化,虽然没有发现显著性的差异(P=0.09)。斑节对虾Pm Amy在整个生长阶段的检测中都有表达,其中幼体发育过程中存在显著性差异,糠虾时期Pm Amy表达量显著高于无节幼体、溞状幼体和仔虾时期(P<0.05)。以上实验结果初步说明了Pm Amy可能与斑节对虾的幼体发育相关。