摘要: [目的]本研究克隆了中华蜜蜂Apis cerana cerana Fabricius foraging(Acfor)基因,并对其进行了序列和基因表达分析,为研究该基因参与蜜蜂劳动分工的分子机理及蜜蜂采集行为调控奠定基础。[方法]利用RT-PCR技术扩增和克隆获得Acfor的全长序列,采用生物信息学软件对其蛋白进行结构特点分析;采用qRT-PCR对Acfor基因的表达特性进行分析;环鸟苷酸依赖的蛋白激酶(PKG)活性采用比色法检测。[结果]Acfor cDNA全长为3 029 bp(GenBank登录号为,KP662686.1),ORF序列长度为2169 bp,编码722个氨基酸。预测该蛋白分子量为81.80 ku,理论等电点(PI)5.50,为酸性、稳定的、亲水性蛋白,无信号肽和跨膜结构,存在2个糖基化位点和38个潜在磷酸化位点,主要分布在细胞质中;二级结构中,有卷曲环、α-螺旋和伸展链3种结构,三者比例分别为57.06%、28.12%和14.82%;系统发育树结果显示,中华蜜蜂Acfor和其它膜翅目for组成了一个大的分支,分支由7个亚支构成,Acfor与Amfor分子距离最近。不同日龄工蜂Acfor mRNA的表达和PKG活性的趋势一致,130日龄均有表达和PKG活性,110日龄表达量和活性下降,10日龄后开始上升,25日龄表达量和活性最高,然后随着日龄的增加而下降。[结论]可见,Acfor基因表达和PKG活性水平影响中华蜜蜂与日龄有关的采集行为。

摘要: 【目的】RBP1是一种参与黑腹果蝇Drosophila melanogaster性别决定基因doublesex(dsx)premRNA选择性剪接的重要剪接因子。本研究旨在克隆RBP1基因在西方蜜蜂Apis mellifera中的同源基因AmRBP1,分析其结构域及其在西方蜜蜂性别决定初期胚胎和幼虫不同发育阶段中的表达模式,以期为研究该基因是否参与蜜蜂性别决定奠定基础。【方法】基于NCBI中提交的西方蜜蜂基因数据库和转录组数据库,利用黑腹果蝇rbp1对数据库进行同源检索获得RBP1的转录组序列,并设计引物进行PCR扩增克隆AmRBP1基因,利用生物信息学软件对其进行核酸及氨基酸序列分析。采用半定量RT-PCR技术分析该基因在西方蜜蜂胚胎及幼虫期的表达模式。【结果】由序列比对分析可知,西方蜜蜂AmRBP1基因的pre-mRNA含有3种不同的选择性剪切形式。通过设计不同的引物,克隆得到3种成熟的mRNA序列,分别命名为AmRBP1-R1(Gen Bank登录号:KY404154)、AmRBP1-R2(Gen Bank登录号:KY404155)和AmRBP1-R3(Gen Bank登录号:KY404156);mRNA长度分别为696,790和771 nt,编码的蛋白大小分别为130,166和162 aa;结构域分析发现AmRBP1的3种选择性剪切形式具有相同的结构域,氨基端含有一个RRM结构域,羧基端含有一个RS结构域。同源性分析表明,西方蜜蜂AmRBP1与丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis、红火蚁Solenopsis invicta、埃及伊蚊Aedes aegypti、黑腹果蝇D.melanogaster、家蚕Bombyx mori、家蝇Musca domestica和中华按蚊Anopheles sinensis RBP1蛋白氨基酸序列一致性分别为96.97%,94.20%,84.85%,81.48%,80.28%,78.15%和69.23%。半定量RT-PCR结果表明,AmRBP1基因的3种剪切形式(AmRBP1-R1-3)在西方蜜蜂胚胎和幼虫各时期均有表达,无雌特异性或雄特异性表达的剪切形式。【结论】西方蜜蜂AmRBP1可能是一种SR家族剪切因子,其有可能参与调控基因表达的特定剪切,但其是否参与doublesex(dsx)基因pre-mRNA的性别特异性剪切需要进一步研究。

摘要: 【目的】海藻糖合成酶(trealose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖合成过程中的关键酶之一。本研究旨在克隆沙葱萤叶甲Galeruca daurica海藻糖合成酶基因,分析其对不同温度胁迫的响应,以期进一步揭示沙葱萤叶甲耐温性的分子调控机制。【方法】通过RACE技术克隆沙葱萤叶甲TPS基因的全长cDNA序列,并对该基因进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR方法检测TPS基因在不同温度下沙葱萤叶甲2龄幼虫中的表达量变化。【结果】克隆获得沙葱萤叶甲TPS基因,将其命名为GdTPS(Gen Bank登录号:KY460114),该基因全长2 706 bp,开放阅读框(ORF)长2 496 bp,编码831个氨基酸;蛋白预测分子量为94.05 kD,等电点为6.82,无信号肽和跨膜结构,包含3个N-糖基化位点。GdTPS有两个保守功能区,与其他昆虫TPS具有较高的同源性,其中与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata TPS亲缘关系最近,氨基酸序列一致性为88%。实时荧光定量PCR结果表明,温度低于25℃(对照)时,GdTPS表达量随着温度下降而上升,-10℃时达到最高值;高于25℃时,GdTPS表达量随着温度上升而上升,40℃时达到最高值。【结论】沙葱萤叶甲幼虫通过上调GdTPS的表达来应对高温和低温胁迫,该结果为揭示TPS在昆虫应对温度胁迫过程中作用的分子机制提供了基础。

摘要: 【目的】Polycalin蛋白是一种新发现的Bt毒素受体,可能与昆虫对Bt的抗性有关。本研究旨在明确小菜蛾Plutella xylostella Polycalin蛋白与Bt Cry1Ac毒素的关系。【方法】本研究通过PCR结合RACE技术从小菜蛾3龄幼虫中肠克隆获得Polycalin蛋白基因的全长cDNA序列,采用实时定量PCR技术研究Polycalin蛋白在小菜蛾不同发育阶段、4龄幼虫不同组织及用不同浓度Cry1Ac毒素饲喂3龄幼虫后的表达量。提取小菜蛾幼虫中肠的刷状缘膜囊泡(BBMV),运用合成多肽的方法制备Polycalin蛋白抗体,利用Western blot和Ligand blot技术对小菜蛾Polycalin蛋白进行鉴定,分析其与Cry1Ac毒素的结合特性。【结果】克隆得到的小菜蛾Polycalin蛋白基因的cDNA序列全长为9 102 bp(GenBank登录号:MF138149),其中,开放阅读框为8 778 bp,编码2 925个氨基酸;预测蛋白质分子量为326.38 kD,等电点为4.39;在推导的氨基酸序列中,前20个氨基酸为N-末端信号肽序列,含有14个N-糖基化位点,67个O-糖基化位点,6个脂质运载蛋白特征序列,6个脂质运载蛋白位点和13个类脂质运载蛋白结构域,并且在第20和21位(TSG-QVV)氨基酸之间存在一个裂解位点,在C-末端存在2个GPI结合位点,具有Bt毒素受体的特征。该蛋白在幼虫期的表达量较高,尤其在3龄幼虫体内表达量最高,在蛹和成虫中的表达量最低;在4龄幼虫的头、胸、腹中均有表达,在幼虫腹部中的表达量最高;3龄幼虫取食不同浓度的Cry1Ac毒素后,Polycalin蛋白的表达量下降,且Cry1Ac毒素浓度越高,下降越明显。通过Western blot检测到小菜蛾中肠刷状缘膜囊泡(BBMV)上存在大约300 kD的Polycalin蛋白条带;Ligand blot实验证明了小菜蛾Polycalin蛋白能与Cry1Ac毒素结合。【结论】本研究首次初步明确了小菜蛾Polycalin蛋白具有与Bt毒素结合的特性,为研究Bt对昆虫的作用机理和利用Bt防治害虫提供一定的理论基础和参考价值。

摘要: 【目的】克隆绿盲蝽Apolygus lucorum核受体基因E75D全长,明确其表达谱,并获得该基因的重组蛋白及制备其单克隆抗体。【方法】利用RACE法克隆绿盲蝽核受体基因Al E75D全长;qRTPCR法分析绿盲蝽不同日龄成虫(1-16 d)及7日龄雌成虫6种组织(脂肪体、飞行肌、卵巢、马氏管、中肠和表皮)中该基因的mRNA相对表达水平;利用NdeⅠ和XbaⅠ双酶切含有目的基因的p MD18-T载体后进行亚克隆,再利用IPTG诱导的重组质粒进行特异性表达重组蛋白,通过GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析纯化靶蛋白;最后通过小鼠免疫、细胞融合及腹水制备重组蛋白的单克隆抗体,Western blot验证该抗体的特异性。【结果】从绿盲蝽中克隆获得蜕皮激素核受体基因Al E75D(Gen Bank登录号:KX912700),其开放阅读框长1 911 bp,编码636个氨基酸,预测分子量为75.68 k D;该基因编码蛋白具有E75D的典型特征,由A/B域(23 aa)、D域(85 aa)、E域(190aa)和F域(338 aa)组成,但缺失C域;绿盲蝽Al E75D的氨基酸序列与半翅目蝽科的豆荚草盲蝽Lygus hesperus的E75D序列一致性最高(为98%)。Al E75D在整个绿盲蝽成虫期均有表达,在7日龄雌成虫中达到峰值;此外,Al E75D在雌成虫6个供试组织中也均有表达,并在脂肪体及卵巢中高表达。双酶切后的重组克隆载体可成功亚克隆到p Czn1载体上,IPTG可成功诱导p Czn1-Al E75D重组质粒特异性表达一个约75 k D的蛋白。用Ni-NTA琼脂糖树脂凝胶纯化重组蛋白,以纯化的重组蛋白为抗原,获得了一株能稳定传代并分泌抗Al E75D蛋白单克隆抗体的细胞株,该单克隆抗体可与绿盲蝽总蛋白及Al E75D重组蛋白特异性结合。【结论】Al E75D在绿盲蝽体内的表达谱表现出发育阶段特异性和组织特异性;本研究获得的其重组蛋白的单克隆抗体具有高特异性。结果为进一步在蛋白水平上分析该基因的功能奠定基础。