摘要: 【目的】本研究旨在阐明暗黑鳃金龟Holotrichia parallela UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UAP)基因HpUAP的序列特征和功能。【方法】通过PCR方法从暗黑鳃金龟2龄幼虫中扩增HpUAP全长cDNA序列，并进行生物信息学分析；构建pET30a-HpUAP重组表达载体，转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达；利用qRT-PCR检测HpUAP在暗黑鳃金龟幼虫不同发育阶段(1-3龄幼虫)和3龄第2天幼虫不同组织(体壁、中肠、直肠、回肠、马氏管和脂肪体)中的表达量。利用RNAi沉默暗黑鳃金龟2龄幼虫体内HpUAP基因后，观察其生长发育和存活情况，并测定RNAi 72 h后其HpUAP表达量和体壁几丁质含量。【结果】PCR扩增获得暗黑鳃金龟HpUAP全长cDNA序列(GenBank登录号：MW676788),开放阅读框长1 461 bp,编码486个氨基酸残基，蛋白分子量约为53.9 kD。系统进化分析发现HpUAP与似牛嗡蜣螂Onthophagus taurinus UAP的氨基酸序列以较高的置信度聚为一个分支。经IPTG诱导可表达53.9 kD的HpUAP蛋白，与预期大小一致。发育表达谱结果表明HpUAP在1龄第1天和3龄第1天暗黑鳃金龟幼虫中表达量较高，组织表达谱结果表明HpUAP在暗黑鳃金龟3龄第2天幼虫中肠和体壁中表达量较高。HpUAP RNAi导致暗黑鳃金龟2龄幼虫生长与行动缓慢，体表颜色加深并皱缩；RNAi处理72 h后，与对照组(dsGFP注射组)相比，dsHpUAP注射组HpUAP表达量下降了93.06%,死亡率增加了40%左右，表皮几丁质含量下降了约29%。【结论】结果说明HpUAP参与几丁质代谢，在暗黑鳃金龟幼虫的生长发育过程中起关键作用。

摘要: 【目的】明确苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)晶体蛋白对暗黑鳃金龟Holotrichia parallela幼虫的杀虫机制。【方法】基于暗黑鳃金龟转录组数据，PCR克隆暗黑鳃金龟碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)基因HpALP全长cDNA序列；利用原核表达系统在体外表达HpALP,并进行Western blot检测；利用qRT-PCR测定HpALP在暗黑鳃金龟3龄第2天幼虫不同组织(前肠、中肠、直肠、回肠、马氏管、脂肪体和体壁)中的表达水平；利用配体印记实验及ELISA技术对HpALP蛋白与苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry8Ea3体外结合特性进行分析。【结果】得到了暗黑鳃金龟HpALP全长cDNA (GenBank登录号：MZ004964),长1 536 bp,编码512个氨基酸，预测蛋白质分子量为57.32 kD,等电点为4.70;HpALP与食粪金龟Onthophagus taurus ALP的氨基酸序列一致性最高；原核表达获得重组蛋白HpALP,经Western blot检测HpALP重组蛋白在IPTG诱导8 h时的表达量最高。qRT-PCR分析的组织表达谱结果表明，HpALP在幼虫前肠中丰度最高。HpALP重组蛋白可以与Cry8Ea3特异结合，解离常数Kd值为76.21±26.44 nmol/L,最大亲合力Bmax值为0.59±0.068;而HpALP重组蛋白与对照Cry1Ab35不结合，Kd值为142.50±137.30 nmol/L,Bmax值为0.013±0.005。【结论】分离鉴定了暗黑鳃金龟HpALP蛋白，它与Bt Cry8Ea3亲和力强，推断其为Cry8Ea3的受体蛋白。研究结果为明确Cry8Ea3蛋白对暗黑鳃金龟的作用机制提供了理论依据。

摘要: 【目的】华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita是一种分布范围广,寄主种类多的农业害虫。本研究鉴定了桃树顶空挥发物中对华北大黑鳃金龟雌虫具有触角电生理活性的化合物,并探索桃树挥发物活性成分的剂量对华北大黑鳃金龟雌、雄虫触角电生理反应的影响。【方法】采用顶空吸附法收集桃树枝叶挥发物,用气相色谱-触角电位联用技术(GC-EAD)和气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)鉴定有电生理活性的桃树挥发物成分,最后用触角电位(electroantennograph, EAG)技术测试这些挥发物在0.01, 0.1, 1, 10和100μg剂量下引起的华北大黑鳃金龟雌、雄成虫EAG反应。【结果】桃树挥发物中能引起华北大黑鳃金龟雌成虫触角电生理反应的成分有7种,包括Z-β-罗勒烯、顺-3-己烯乙酸酯、顺-3-己烯醇、壬醛、水杨酸甲酯以及2种未知化合物。所测试的对华北大黑鳃金龟雌成虫触角具有电生理活性的5种桃树挥发物成分在各剂量下都能引起雌、雄成虫明显的EAG反应。雌、雄虫对同种物质的EAG反应随着剂量的增加而有增大的趋势,并且雌虫的EAG反应显著高于雄虫。【结论】桃树挥发物中,罗勒烯、顺-3-己烯乙酸酯、顺-3-己烯醇、壬醛、水杨酸甲酯均能引起华北大黑鳃金龟雌、雄成虫的剂量依赖性的触角电生理反应,而且存在显著的性别差异。可利用这些化合物开展行为反应和田间诱集试验,进一步验证其对华北大黑鳃金龟的引诱活性。

摘要: 【目的】明确重要生态因素对暗黑鳃金龟Holotrichia parallela幼虫种群的影响,从而为预测预报其发生提供理论依据。【方法】在室内采用自动控制温度、人工控制湿度的方法,观察温度、湿度和食物对暗黑鳃金龟幼虫存活率及发育历期的影响。【结果】结果表明,2028℃适宜暗黑鳃金龟1-2龄幼虫的存活,其中24℃时存活率最高,达到74.9%±3.1%;12℃时发育历期最长,32℃时发育历期最短,20℃和24℃下发育历期适中。土壤含水量为7%19%时暗黑鳃金龟1-2龄幼虫均能存活;其中在7%和19%时,幼虫存活率低于50%,在25%时幼虫全部死亡;在土壤含水量为16%时存活率最高,达到76.4%±2.5%。在供试的6种食物(小麦根、玉米根、棉花根、花生根、大豆根和马铃薯块)中,喂饲花生根的暗黑鳃金龟幼虫存活率最高,达到68.7%±3.2%。取食不同食物的幼虫发育历期差异显著,其中取食花生根的暗黑鳃金龟幼虫期最短,整个幼虫期仅为259 d(3龄幼虫期为227 d);而取食棉花根的幼虫期最长,整个幼虫期为346 d(3龄幼虫期为303 d)。【结论】温度、土壤含水量和食物对暗黑鳃金龟幼虫的存活和生长发育均具有显著影响;在幼虫期调控温湿度及改变其寄主植物结构可有效控制其发生危害。

摘要: 【目的】暗黑鳃金龟Holotrichia parallela通过气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)识别性信息素和植物挥发物准确而迅速地定位配偶、寄主植物。本研究通过克隆暗黑鳃金龟气味结合蛋白15a(Hpar OBP15a)基因,解析该基因的编码蛋白特征、组织表达模式及与寄主植物气味等化合物的结合特性方面的研究,为阐明暗黑鳃金龟基于嗅觉识别的寄主植物选择机理奠定理论基础。【方法】根据暗黑鳃金龟成虫触角转录组测序的结果,利用RT-PCR克隆了Hpar OBP15a基因;Real-time PCR方法分析了该基因在成虫不同部位的表达量差异;荧光竞争结合测定了Hpar OBP15a蛋白和58种候选化合物的结合特征。【结果】暗黑鳃金龟Hpar OBP15a基因全长534 bp,编码147个氨基酸,Gen Bank登录号为AK1834747。Hpar OBP15a在触角中特异表达,且在雌虫触角中表达量显著高于雄虫。在被测的58种化合物中,Hpar OBP15a与46种气味化合物具有较好的亲和性,其中与十二烷、十二醇结合能力最强,其解离常数分别为8.5和11.3μmol/L;同时,对性信息素(L-异亮氨酸甲酯和R-芳樟醇)也有一定的结合能力(解离常数分别为21.0和18.5μmol/L)。【结论】Hpar OBP15a具有广泛的气味结合谱,其中对榆树挥发物十二烷的结合能力最强,因此该蛋白可能在暗黑鳃金龟对榆树的定位过程中具有重要作用。