摘要: 为了进一步解析鱼类在高原低氧环境下的适应性进化机制,确定相关基因KLF17是否在红细胞发育过程中发挥功能。将高原裂腹鱼亚科鱼类的代表物种——花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)作为实验对象,以实验室前期花斑裸鲤全基因组测序数据为基础,鉴定出红细胞发育相关基因KLF17启动子序列,以其启动子DNA为诱饵,对花斑裸鲤肾脏组织蛋白进行筛选,采用LC-MS/MS技术对候选结合蛋白进行鉴定分析,并进行生物信息学分析。结果表明,在花斑裸鲤肾脏组织中共筛选到576个与KLF17启动子区域特异性结合的蛋白,去除未能鉴定到的蛋白,共有306个候选结合蛋白,其中包括真核翻译起始因子2、细胞色素P450酶、转铁蛋白、含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶、丙酮酸脱氢酶、红细胞膜蛋白带4.1蛋白等与红细胞或造血相关的蛋白。GO功能富集分析表明,这些候选结合蛋白涉及多种生物学功能,包括参与细胞生长、细胞周期、免疫反应、信号传导、核酸与转录因子结合等过程。KEGG通路分析表明,以上蛋白参与多条信号通路,包括氨基酸代谢通路、细胞凋亡信号通路、PPAR信号通路、Hippo信号通路、细胞色素P450代谢信号通路、HIF-1信号通路及神经营养因子信号通路等。研究筛选出的KLF17启动子候选结合蛋白主要有参与红细胞发育相关的真核翻译起始因子2、细胞色素P450酶、转铁蛋白等,经过功能分析发现它们参与HIF-1信号通路,通过调控血红素、珠蛋白基因表达、铁代谢、血管生成、糖酵解等途径激发红细胞的生成与发育,提示KLF17在转录水平上参与调控红细胞中血红素、铁和珠蛋白间的相互作用,为红细胞分化机制研究提供重要信息。同时,转铁蛋白作为参与铁和氧调节的交叉调控因子,它能够促进血液中铁的运输和增强血氧的结合能力,使得机体在低氧环境中长期生存,这也揭示了花斑裸鲤的低氧适应机制与HIF-1下游的转铁蛋白有关。研究可对下一步验证该蛋白与KLF17的互作机制提供研究基础,为解析高原土著鱼类造血系统发育和低氧环境适应性进化的分子机制提供科学数据。

摘要: 以鲤(Cyprinus carpio L.)为受试对象,探究3种不同烷基链咪唑类离子液体(Alkyl ionic liquids,AILs)([C_6mim]Cl、[C_8mim]Cl和[C_(12)mim]Cl,暴露浓度分别为4.97、2.15和0.09 mg/L)对鲤肠道的毒性作用。结果表明随烷基链长度增加,与对照组(NC)相比(1)鲤肠绒毛高度和肌层厚度显著降低(P<0.05);(2)[C_8mim]Cl组T-AOC水平显著性升高(P<0.05);[C_(12)mim]Cl组GSH-Px、LDH、ACP酶活性和T-AOC水平显著性升高(P<0.05);(3)促炎因子IL-6、IL-8基因表达量显著升高(P<0.05),[C_(12)mim]Cl组尤为明显;(4)[C_6mim]Cl和[C_(12)mim]Cl组鲤肠道菌群Chao1和Ace指数显著升高(P<0.05)。PCoA和UPGMA聚类分析结果表明3种AILs暴露改变了鲤肠道菌群组成。[C_8mim]Cl和[C_(12)mim]Cl组有益菌厚壁菌门(Firmicutes)丰度显著降低(P<0.05)。3种AILs暴露均使黄杆菌属(Flavobacterium)等致病菌丰度显著增加(P<0.05),鲸杆菌属(Cetobacterium)等有益菌丰度降低。PICRUSt2菌群功能预测分析发现,[C_6mim]Cl、[C_(12)mim]Cl组辅助因子和维生素代谢、外源生物降解和代谢等与碳氮循环功能相关途径丰度升高。综上,不同烷基链AILs暴露均可造成鲤肠道组织形态改变、氧化应激和免疫损伤,改变肠道菌群结构,且毒性随烷基链长度增加呈一定上升趋势。研究结果将为不同烷基链AILs对鱼类肠道的生态毒性机制研究提供一定的理论依据。

摘要: 研究利用扫描电镜和HE染色技术来观察青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)的肠道显微结构,并通过DNA宏条形码技术,对其食性特点进行分析。研究结果表明,青海湖裸鲤前、中、后肠的组织结构层次清晰且差异明显,从内向外依次由黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层四层组成,因缺乏黏膜肌,光镜下仅有三层膜结构清晰可见,从前肠至后肠肠腔逐渐减小,黏膜皱褶高度显著降低(P<0.05),宽度显著增加(P<0.05),杯状细胞、分泌孔及分泌物颗粒的数量也相对减少; 18S rDNA和rbcL基因DNA宏条形码测序分析结果显示:青海湖裸鲤肠道内容物测序获得51656个OTU,剔除鱼类自身序列、细菌、古菌及真菌的序列后共39031个OTU注释为43门、114纲、282目和435科。在门水平上主要以链型植物门(53.73%)、硅藻门(23.19%)、p＿unclassified＿d＿Eukaryota(11.14%)、丝足虫门(6.67%)、p＿unclassified(1.93%)和轮虫动物门(0.67%)为主,纲水平上,主要以真藓纲(35.79%)、硅藻纲(23.05%)、双子叶植物纲(18.03%)和金藻纲(3.36%)为主。由此可见青海湖裸鲤主要食物组成为真藓类、硅藻类、双子叶植物类、金藻类、丝足虫类、轮虫类及未确定分类的物种。综上所述,青海湖裸鲤的肠道组织结构具有特异性和杂食性鱼类肠道结构的共性,且DNA宏条形码食性分析结果也证实青海湖裸鲤属于杂食性鱼类,其中还有许多未知种类的食物。研究阐明了青海湖裸鲤肠道结构和食性的特点,为青海湖裸鲤的人工繁育和进一步保护提供了基础的科学依据。

摘要: 为建立一种快速、灵敏并适用于临床检测Ⅲ型鲤疱疹病毒(Cy HV-3, KHV)的方法,实验根据KHV SphI-5基因的保守序列片段设计引物及探针,采用重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测KHV。重组酶聚合酶扩增技术(RPA)具恒温扩增及高灵敏度特点,简化了设备要求的同时又能做到高效检测病毒,再结合侧向流动试纸条(LFD)将RPA结果快速地可视化,提高了该疾病的检测效率。结果表明,在38℃的最适反应温度下,采用RPA-AGE技术仅需10min便可检测出病原的目标片段,结合LFD方法仅需5min便可将RPA结果通过试纸条可视化呈现。研究研发的KHV RPA-LFD检测方法简单、快捷,可为实验条件有限的养殖场快速诊断需求提供技术支撑。

摘要: 为深入探究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)在感染过程中的生物学功能,构建了ORF66截短基因的原核表达质粒pET28a-tORF66,转化至BL21感受态细胞后利用IPTG(Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside) 16℃诱导蛋白表达,经尿素溶解透析获得溶解的重组蛋白后免疫6周龄小鼠,制备鼠抗tORF66多克隆抗体。将纯化后重组蛋白进行噬菌体展示以此来筛选互作蛋白。经Western Blot检测显示,抗体能够识别感染鲫鳍条细胞系GICF细胞中的鲤疱疹病毒Ⅱ型,效价较高,特异性较好。噬菌体淘选结果通过生物信息学分析显示,得到一条出现频次最高的多肽N′-LHLHQNRMSLSR-C′。该多肽与金鱼基因组中的3个基因有较高的同源性,推断其可能与rORF66重组蛋白相互作用。这将为深入探究ORF66在CyHV-2病毒感染过程中的生物学功能、开发抗CyHV-2病毒新药物及寻找潜在的药物靶点提供新依据。