摘要: Spin蛋白家族是具有Spin/Ssty保守结构域并在配子发生过程中发挥关键作用的一类分子。研究利用简并引物PCR,从斑马鱼成熟卵母细胞SMART cDNA文库中筛选到260 bp的DrSpin-1和DrSpin-2部分序列,经序列同源性比对,斑马鱼DrSpin-1的部分氨基酸序列与银鲫CagSpin一致性高达81%。利用RACEPCR从该cDNA文库中获得斑马鱼DrSpin-1的全长cDNA序列。序列分析表明,DrSpin-1全长cDNA为1082 bp,开放阅读框771 bp,编码257个氨基酸,具有三个Spin/Ssty保守域,8个可能的磷酸化位点,初步确定斑马鱼DrSpin-1是Spin基因家族成员。斑马鱼DrSpin-1蛋白与已报道的鱼类Spin蛋白多重序列比对表明,DrSpin-1蛋白与银鲫CagSpin蛋白同源性最高。可以推测克隆得到的斑马鱼DrSpin-1与已知功能的银鲫CagSpin具有相近的表达谱和生物学功能,可能在配子发生和受精过程中发挥重要作用。

摘要: IFIT家族由一类受干扰素诱导表达并具有TPR结构域的蛋白组成,但是在鱼类关于IFIT基因的研究还很少。研究利用哺乳类IFIT家族基因IFI56的序列搜索斑马鱼基因组数据库鉴定出一个未知基因,该基因具有哺乳类IFIT家族保守的基因组结构,编码蛋白具有保守的TPR结构域,暂命名为IFIT-A。RT-PCR分析表明,Poly I:C能够诱导IFIT-A基因转录水平上调。与哺乳类IFIT家族基因相似,斑马鱼IFIT-A启动子存在ISG基因特有的典型ISRE结构域。荧光素酶活性实验揭示Poly I:C和重组IFN蛋白能激活斑马鱼IFIT-A启动子活性。此外,过量表达IFN调控因子IRF3和IRF7能诱导斑马鱼IFIT-A启动子活性。实验结果证明IFIT-A基因是斑马鱼IFIT家族成员,IRF3和IRF7在其诱导表中具有重要调控作用。

摘要: 研究表明,夹竹桃(Nerium indicum Mill.)及其提取物对多种害虫具有较强的毒杀作用,已在害虫生物防治中显示出较大作用。为了合理开发夹竹桃植物,需要进一步评价夹竹桃植物对水生生物的安全性和对动物的毒理学。文章利用索氏提取法提取夹竹桃叶乙醇粗提物,并进一步用氯仿萃取浓缩、硅胶柱层析方法提取分离乙醇精提物,经鉴定为强心甙组分。在此基础上,委托浙江省医学科学院评价了乙醇粗提物对实验动物的毒理学,并采用静态法评价了这二种提取物对斑马鱼(Brachydanio rerio)的急性毒性和慢性效应。结果表明:夹竹桃叶乙醇粗提物的提取率为45%,乙醇精提物(主要成分为强心甙组分)的提取率为0.25%。乙醇粗取物对大鼠经口和经皮毒性为低毒级,对家兔皮肤和眼无刺激,对豚鼠的致敏反应属弱致敏性。这说明夹竹桃叶乙醇粗提物对哺乳动物十分安全。在急性毒性试验中,发现斑马鱼的死亡率与提取物处理浓度和处理时间均呈明显的正相关。处理浓度越大,斑马鱼的死亡率越高;同一浓度处理时间越长,死亡率越高。用24 mg/L乙醇粗提物处理6、12、24和48h的死亡率分别为26.67%、60%、91.11%和95.56%;用0.5 mg/L乙醇精提物处理12、24、48、72和96h的死亡率分别为6.25%、33.33%、52.08%、54.17%和60.42%;用24 mg/L乙醇粗提物处理96h或32 mg/L处理48h,或者用1 mg/L乙醇精提物处理24h,斑马鱼全部死亡。在慢性毒性试验中,用3.33—10.0 mg/L乙醇粗提物处理斑马鱼28d,其死亡率为12%—20%。乙醇粗提物处理斑马鱼后,急性毒性LC50=12.52 mg/L(药后96h)>10 mg/L,慢性毒性LC50=199.51 mg/L(药后28d);乙醇精提物处理斑马鱼后,急性毒性LC50=0.46 mg/L(药后96h)<1 mg/L,根据《化学农药环境安全评价试验准则》(1990)中农药对鱼类的毒性分级标准,说明夹竹桃叶乙醇粗提物对斑马鱼的毒性属于低毒,比较安全;乙醇精提物对斑马鱼的毒性则为高毒,十分不安全。

摘要: 采用RT-PCR和RACE相结合的方法,克隆得到了斑马鱼的akt3/pkbγ基因,其cDNA全长为2874 bp,编码479个氨基酸。斑马鱼Akt3具有Akt家族成员间保守的PH结构域、催化活性结构域和调节结构域以及两个保守的磷酸化位点Thr305和Ser472。与已发表的人、大鼠、小鼠的Akt3氨基酸序列比较,相似性分别为95.8%、94.7%和95.4%。对斑马鱼早期胚胎进行RT-PCR检测显示,akt3在0—4hpf(hours post fertilization)含量水平较高,6hpf到12hpf降低至较低水平,16hpf后表达量开始逐渐上升,60hpf至96hpf则稳定在较高水平。原位杂交结果表明:akt3在2hpf至96hpf的胚胎中整体都有表达,没有组织特异性。在成鱼中,除鳃部外,akt3在所检测的其他各组织器官中均有表达,在脑部和卵巢表达量较高;利用显微注射持续表达myr-akt3 mRNA研究其功能充分性时结果显示,过量表达斑马鱼akt3 mRNA能使斑马鱼胚胎发育滞后且伴随着尾部短粗、体节模糊、尾末端膨大甚至严重缩短等不同程度畸形。而在斑马鱼myr-akt3注射组发育至24hpf时观察(以排除akt3造成的发育延迟的影响),发现注射过akt3的斑马鱼胚胎的脑部厚度较对照组显著增大,表明akt3对斑马鱼胚胎脑部尺寸发育有影响。

摘要: GHR信号通路在动物出生后的生长中扮演着重要角色。实验利用斑马鱼模型研究了GHR信号相关基因在成体组织、胚胎发育以及幼体期的表达情况,这些基因包括gh、ghra、ghrb、jak2a、jak2b、stat5.1、stat5.2、igf1、c-fos、socs1和socs2。值得关注的是,上述的大部分基因都存在母源性表达,且它们的合子表达均起始在体节早期之前。这说明在有功能性的脑垂体形成之前和完善的循环系统建立之前,GH及GH信号相关因子就已经存在于早期胚胎中,因此GH很可能是控制胚胎发育的一系列自分泌/旁分泌生长因子中的一员。同时,我们发现成体组织的socs表达水平与GH信号靶基因igf1和c-fos的表达呈某种程度的负相关。我们利用实时定量PCR技术和荧光素酶分析技术,通过注射GH和GHR表达载体,在斑马鱼胚胎中分析了它们促进GH信号靶基因c-fos和igf1转录活性以及GH应激启动子spi2.1活性的能力。由此,研究利用斑马鱼胚胎建立一个体内研究模型来评估发育过程中的GH信号激活(GHSA)。在受精后1天(dpf)和3dpf斑马鱼胚胎中,单独过表达gh或ghr均可以显著刺激GHSA,这表明在1dpf的斑马鱼胚胎中即存在功能性的GH和GHR蛋白表达,而这一时期是在功能性垂体的形成之前的。gh以及ghr的协同过表达则可以显著放大gh或ghr单独过表达的GHSA效果。