摘要: 研究基于四级阻抗技术的在线生物监测系统,参照国家地表水环境质量标准(GB3838-2002)中对Ⅰ类和Ⅳ类地表水氨氮质量标准的限值分类,探究0.15和1.5 mg/L氨氮胁迫下15d内斑马鱼(Danio rerio)行为响应,为环境胁迫下斑马鱼的行为响应提供数据支撑。实验采用斑马鱼游动强度和速率综合行为强度来反映其行为变化,对实验数据进行SPSS差异性分析、自相关分析(Autocorrelation)和自组织神经网络(Self-organization mapping net, SOM)分析。研究结果:(1)在对照组中,行为强度数据平均值为0.69±0.13,光周期行为强度数据(0.73±0.13)高于暗周期(0.66±0.14; P<0.01),且光暗周期差异值为10.61%;在氨氮胁迫组(NH3-N, 0.15和1.5 mg/L)实验中,斑马鱼行为强度平均值分别为0.68±0.09和0.64±0.09,差异值分别为7.6%和18.64%,与对照组相同,光周期行为强度明显高于暗周期(P<0.01),证明斑马鱼的昼夜节律性。(2)在氨氮胁迫下斑马鱼行为响应最显著的特点是行为活动遭到抑制。低浓度胁迫轻微抑制,高浓度胁迫严重抑制。在有效氨氮浓度下,浓度越高,抑制作用越明显(P<0.001)。(3)斑马鱼行为响应具有显著的昼夜节律现象。Autocorrelation中正负相关峰值交替性出现,总体表现出较为良好的对称性和以24h循环的周期性,通过SOM分析,大部分行为强度数据与光暗周期时间分布相匹配,说明斑马鱼的昼夜节律现象。研究表明斑马鱼行为响应具有明显的昼夜节律现象,光周期行为强度高于暗周期,周期为24h左右;在氨氮胁迫下斑马鱼行为强度遭到抑制,在有效氨氮浓度下浓度越高,抑制作用越明显,出现时间节点延迟和聚类分析异常的现象。研究使用第三代在线生物行为监测系统,其灵敏性和精确度显著提高,能够实时准确反映氨氮胁迫下斑马鱼的行为响应变化,也表明在线生物监测技术在水生生物行为学研究中发挥着不可或缺的作用。

摘要: 研究以斑马鱼(Danio rerio)为研究模型,选择心脏和血管荧光标记的2个品系斑马鱼为实验材料,设定低氧和常氧2种水体溶氧条件,用荧光显微镜检测低氧胁迫对胚胎形态结构、心脏和血管外部形态、心率、胚胎躯干部主要血管形成的影响。研究发现低氧导致胚胎存活率低于常氧。低氧不仅滞后胚胎发育,而且造成胚胎形态异常。低氧胁迫后斑马鱼胚胎心包水肿、心管发育停滞,心脏虽有房室之分,但其不能向右环化。斑马鱼胚胎血管发育受低氧影响也较大,低氧使胚胎背主动脉和后主静脉直径变窄、后主静脉到背部纵向血管距离变短,胚胎体节间血管生长异常,脊索旁血管特异性消失,肠下静脉血管未出现。为进一步探讨低氧影响斑马鱼胚胎心血管发育的机制,使用整胚原位杂交(ISH)和qPCR检测溶氧对心血管发育相关基因表达组织和表达量的改变。结果提示低氧可能通过Tbx5基因影响心脏的环化过程,心脏环化障碍是低氧引起心脏发育异常的始发环节。低氧可能通过VGEF/VGEFR途径和Notch信号途径影响胚胎血管的正常发育。综上,低氧导致斑马鱼胚胎发育显著滞后,心脏和血管形态发育缺陷,发育相关基因表达异常。斑马鱼早期胚胎发育受低氧胁迫后对成体的形态结构和生理机能有何影响,还需进一步研究。

摘要: 研究利用CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼elovl8a~(-/-)、elovl8b~(-/-)和DKO(elovl8a和elovl8b)敲除模型,通过组织学观察、实时荧光定量PCR和脂肪酸组成分析等实验方法,探究了脂肪酸延长酶8(elovl8)缺失对斑马鱼抗冷胁迫能力的影响。结果表明elovl8缺失导致斑马鱼在低温环境下的存活率显著降低,肝脏伴有明显的脂质沉积和脂肪病变。实时荧光定量PCR结果显示elovl8a和elovl8b缺失造成脂质代谢相关基因的显著变化:elovl8a~(-/-)肝脏中硬质酰-辅酶A脱氢酶(scd)和乙酰辅酶A羧化酶a(acaca)转录水平显著升高,脂肪分解基因包括脂肪甘油三酯脂肪酶(pnpla2)、激素敏感性脂解酶a(lipea)和脂蛋白脂解酶(lpl)表达量显著下降。elovl8b~(-/-)肝脏中脂肪合成酶(fasn)、scd、acaca及pnpla2、lipea和lpl表达水平都显著升高,而DKO肝脏中脂质代谢基因表达都显著下降。脂肪酸分析显示,在低温胁迫下elovl8的缺失造成肝脏C20:0脂肪酸的显著累积,表明elovl8可能对C20:0的延长有作用。研究证明了elovl8在斑马鱼抗冷胁迫过程中起到重要作用,为后续鱼类抵抗低温机制的研究提供新的思路。

摘要: 为鉴定鱼类肌肉组织特异性顺式调控元件,通过分析斑马鱼多个组织的转录组数据,筛选出肌肉高表达基因及低表达基因。通过MEME对肌肉高表达基因和低表达基因非编码区序列特征进行分析,在5个肌肉高表达基因的转录起始位点上游发现了序列保守的DNA区域,包含6个排列顺序一致的DNA基序。将其中一段目标片段插入具有Tol2转座子元件的基础启动子驱动的eGFP编码基因的上游,构建表达载体。注射载体至斑马鱼受精卵获得转基因胚胎,分析胚胎中eGFP荧光的表达模式,发现该DNA片段具有增强基因在肌肉特异性表达的功能。Tomtom预测该DNA区域可能作为Myod等多个转录因子的结合位点。研究结果有助于理解鱼类肌肉基因表达的遗传基础,并为利用生物信息学方法预测组织特异性转录调控元件提供新思路。

摘要: 为了研究豆粕替代鱼粉对鱼类肠黏膜免疫的影响和建立缓解肠炎药物的筛选及功能性饲料添加剂的平台,研究采用固有免疫或适应性免疫细胞荧光标记的斑马鱼品系,通过50%的豆粕添加量替代鱼粉作为蛋白源,共设计了两组饲料,分别在幼鱼固有免疫或适应性免疫的发育阶段中饲喂荧光标记的斑马鱼,构建了斑马鱼豆粕诱导的肠炎模型,对构建的食源性肠炎模型进行了病理、免疫细胞及分子水平的探索。结果表明,在固有免疫方面,斑马鱼通过增加中后肠的中性粒细胞和巨噬细胞的招募、诱导巨噬细胞形态发生抗炎/促炎状态的转换(如形成免疫突触、抗炎/促炎细胞因子等),来应对食源性急性肠炎;在适应性免疫阶段,豆粕饲料促进斑马鱼中后肠淋巴细胞的聚集,包括未成熟的淋巴细胞以及成熟的T淋巴细胞,并且也可发生抗炎/促炎状态转换。从肠道组织病理来说,豆粕替代鱼粉蛋白源会造成肠黏膜损伤,结合切片HE染色显示的肠道物理屏障受到破坏的病理,目前qPCR结果可推测肠道细胞凋亡增加,肠上皮层紧密连接变弱并出现代偿性的细胞增生,同时促炎因子表达增加,免疫细胞聚集肠道,暗示免疫屏障也受损。值得一提的是,斑马鱼幼鱼的适应性免疫发育阶段,即可发生类似成鱼的肠黏膜免疫调控来应对食源性肠炎,例如通过提高调节性免疫细胞转录因子(foxp3)及效应因子(il-10、tgf-beta)来提高肠黏膜的免疫耐受。因此,研究从模式生物的角度,提供了一种快速、可视化的水产动物的食源性肠炎模型及相关功能饲料添加剂的在体研发平台。