摘要: 【目的】筛选针对灰飞虱Laodelphax striatellus RNAi的dsRNA高效纳米递送载体。【方法】使用壳聚糖、碳量子点(carbon quantum dot, CQD)和lipofectamine 2000作为代表性纳米粒子,分别与dsRNA进行混合,形成稳定的3种不同复合颗粒,利用光谱法检测其dsRNA装载率。以灰飞虱膜结合型海藻糖酶基因LsStre为靶标基因来测试3种纳米粒子的RNAi效率。用不同纳米粒子包裹的dsLsStre喂食后,通过荧光实时定量PCR(qPCR)检测喂食后2 d灰飞虱2龄若虫中LsStre mRNA表达水平,并检测和计算灰飞虱2龄若虫在6 d内的校正死亡率,以裸dsLsStre引起的2龄若虫死亡率为对照,评价3种纳米载体对LsStre的RNAi增效作用。【结果】3种纳米载体均能负载dsEgfp,且这3种纳米载体复合dsEgfp的效率均在95%以上。3种纳米材料对灰飞虱2龄若虫的毒性均较弱。同未用纳米粒子包裹的裸dsLsStre喂食组(对LsStre表达量的抑制率为46%)相比,壳聚糖和CQD能够显著提高LsStre的RNAi效率(对LsStre表达量的抑制率分别为78%和84%),而lipofectamine 2000不能显著提高LsStre的RNAi效率(抑制率为52%)。壳聚糖和CQD可以有效提高喂食dsLsStre对灰飞虱2龄若虫的致死效应,在连续喂食6 d后,灰飞虱2龄若虫的校正死亡率分别达到76%和82%,与直接用裸dsLsStre处理的对照组校正死亡率(35%)相比,增效系数分别达到2.17和2.34,lipofectamine 2000的增效能力最弱,其与dsLsStre的复合颗粒处理引起灰飞虱2龄若虫死亡率为38%,增效系数为1.09。【结论】壳聚糖和CQD纳米载体能够显著提高灰飞虱对于喂食dsRNA的敏感性,而lipofectamine 2000的RNAi增效作用较弱。研究结果有助于评价纳米载体在灰飞虱RNAi中的增效作用,为进一步开发和筛选有效的RNAi纳米载体,实现害虫绿色防控,提供了理论依据和应用策略。

摘要: 褐飞虱体内存在大量的共生菌,这些共生菌不但具有种类多样性,同时在对寄主的功能上也存在多样性。目前利用分子生物学手段以及高通量测序技术鉴定得到的测序丰度大于0.1%的共生真菌和共生细菌种类分属19和53个不同的属。由于技术的局限性和共生菌难以离体培养的特性,仍有相当部分共生菌分类地位尚未明确。共生菌在褐飞虱的生长、发育、繁殖、营养代谢、抗性变异以及免疫功能等生命活动中起着至关重要的作用,种类丰富的共生菌发挥着不同的功能。共生真菌主要参与固醇类物质和必需氨基酸的合成,而共生细菌则主要参与维生素的合成。共生菌在褐飞虱致害性变异、抗药性发展以及对宿主的繁殖等方面也都产生了重要的影响,但是具体的分子机制尚未明确。本文针对褐飞虱体内共生菌多样性研究概况进行综述,并对今后的研究侧重点提出了建议,后续研究可以聚焦于:(1)共生菌种类的鉴定;(2)特定、单一种类共生菌的功能;(3)共生菌在褐飞虱体内各组织间的扩散途径、扩散种类和调控机制;(4)以共生菌为靶标进行褐飞虱的防治等。

摘要: 【目的】氨肽酶N(aminopeptidase N, APN)是昆虫消化系统中重要的蛋白酶。本研究旨在对在褐飞虱Nilaparvata lugens中肠中两个具有较高转录水平的apn基因(nlapn1和nlapn4)在中肠上皮细胞上的表达及其蛋白功能特性进行鉴定与分析。【方法】利用最大似然法进行褐飞虱NLAPN1和NLAPN4的系统进化分析;利用Western blot分析NLAPN1及NLAPN4在中肠刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles, BBMVs)中的定位;利用LC-ESI-MS/MS技术对Western blot定位的NLAPN1及NLAPN4进行鉴定。在果蝇Drosophila S2细胞内分别表达两个NLAPN蛋白,并利用Western blot及免疫荧光定位技术对NLAPN1与NLAPN4进行S2细胞内的定位;分别以L-亮氨酸对硝基苯胺(leucine-p-NA)、L-丙氨酸4-硝基苯胺盐酸盐(Ala-p-NA)、L-甲硫氨酸对硝基苯胺盐酸盐(Met-p-NA)和L-赖氨酸对硝基苯胺二氢溴酸盐(Lys-p-NA)为底物测定NLAPN1和NLAPN4的酶活性。【结果】系统进化树分析结果显示,褐飞虱NLAPN1及NLAPN4与其他半翅目昆虫肠道中高表达的APN分在了同一分支中。Western blot及LC-ESI-MS/MS质谱分析结果证明NLAPN1与NLAPN4均存在于褐飞虱中肠刷状缘膜囊泡中,分子量约为160 kD。Western blot及免疫荧光定位结果显示,两个NLAPN蛋白均位于S2细胞膜上,而C端缺失糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol, GPI)锚定位点的NLAPN4lackG蛋白分布在细胞质中。酶活性测定结果显示,以L-丙氨酸4-硝基苯胺盐酸盐及L-赖氨酸对硝基苯胺二氢溴酸盐为底物时NLAPN1和NLAPN4都具有一定的酶活性,而以L-亮氨酸对硝基苯胺为底物时NLAPN1有极高的酶活性(>60 U/mg)。【结论】NLAPN1与NLAPN4是褐飞虱中肠上皮细胞膜上高表达的两个膜结合APN蛋白,且都通过C端的GPI锚定附着在细胞膜上。NLAPN1与NLAPN4与鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫中肠膜结合APN有着近似的蛋白结构与酶学特性。膜结合APN在褐飞虱中肠中的生理生化功能及其与外源病原物的互作机制还有待进一步深入研究。

摘要: 【目的】探明灰飞虱Laodelphax striatellus体内细菌的群落结构和种类多样性。【方法】采用Illumina MiSeq测序平台对新羽化24 h的灰飞虱雌雄成虫体内细菌16S rRNA的V3-V4变异区序列进行高通量测序,应用USEARCH和Silva等软件和数据库来统计样品序列数目和操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)数量,分析灰飞虱雌雄成虫体内细菌的种类组成、丰度、Alpha多样性及其差异。【结果】灰飞虱雌、雄成虫样本分别获得29 333和25 919条有效序列,根据序列相似性进行聚类分析分别获得55和57个OTUs。其中,雌、雄成虫两类样本共有OTU数目20个,特有的OTU数目分别为35和37个。基于OTU物种分类分析,雌雄成虫样本中细菌种类一共覆盖7个门、15个纲、23个目、33个科、56个属和73个种。在门、纲、目和科分类阶元上,雌雄成虫两类样本均以变形菌门(Proteobacteria,雌99.96%/雄99.16%)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria,雌97.76%/雄97.84%)、红螺菌目(Rhodospirillales,雌83.92%/雄53.21%)和醋酸杆菌科(Acetobacteraceae,雌83.90%/雄53.17%)中的细菌为优势菌。在属分类阶元上,灰飞虱雌雄成虫体内优势菌为醋酸杆菌科未分类属(unclassified Acetobacteraceae),沃尔巴克氏体属Wolbachia次之,后者在雌、雄成虫体内丰度分别为13.81%和44.52%。在种水平上,灰飞虱雌、雄成虫体内特有细菌分别为21和32个种,但两类样本中性别特有种的丰度普遍极低,均不足0.5%。【结论】灰飞虱雌雄成虫间细菌群落组成和种类多样性存在差异。本研究为进一步挖掘灰飞虱体内关键微生物并解析其生物学功能及其利用等方面奠定了基础。

摘要: 【目的】蜕皮激素(ecdysone)是调控昆虫生长发育和繁殖的重要激素,其合成主要由5个称为Halloween基因编码的细胞色素P450(spook/CYP307A1,Phantom/CYP306A1,disembodied/CYP302A1,shadow/CYP315A1和shade/CYP314A1)参与。褐飞虱Nilaparvata lugens系东南亚和东亚地区危害最为严重的水稻害虫之一,以蜕皮激素调控基因为靶标,应用RNAi技术防控褐飞虱正逐步成为研究热点。本研究旨在揭示褐飞虱体内Halloween基因的功能,为褐飞虱的防控和新农药的开发提供理论依据。【方法】本研究基于褐飞虱基因组和转录组数据,利用RT-PCR技术克隆了参与蜕皮激素合成的5个Halloween基因;利用生物信息学软件预测分析其编码蛋白的结构特性;利用MEGA5.0邻接法构建系统进化树;利用实时荧光定量PCR技术研究其时空表达特征;利用注射法RNAi技术分析Cyp314a1基因表达下调对褐飞虱生长发育和繁殖的影响。【结果】克隆获得褐飞虱的5个Halloween基因,即NlCyp307a1(Gen Bank登录号:KM217014.1),NlCyp306a1(Gen Bank登录号:KM217013.1),NlCyp302a1(Gen Bank登录号:KM216995.1),NlCyp315a1(Gen Bank登录号:KM216998.1)和NlCyp314a1(Gen Bank登录号:KU928172)。进化分析表明,这5个基因分属于CYP2和线粒体两大类群,并与各自的同源基因聚类在一起,说明Halloween基因和蜕皮激素合成途径在昆虫进化过程中十分保守。Nl CYP314A1具有5个P450的保守结构域和两个跨膜结构域,是典型的线粒体酶。qRT-PCR检测结果显示,5个Halloween基因的表达量在整个褐飞虱5龄若虫期内呈现波动状,且均在5龄若虫蜕皮后的24 h和60 h出现表达量峰值。NlCyp314a1在褐飞虱发育各个龄期均表达,且在成虫中表达量最高;NlCyp314a1在胸部表达量较头部和腹部高,其在脂肪体中的表达量最高,其次是在足、表皮、翅芽中,中肠中表达量最低。利用注射法RNAi对NlCyp314a1基因进行沉默后,NlCyp314a1的表达量在注射后第4天较对照极显著降低84.6%(P<0.01),同时蜕皮激素通路下游的响应关键基因Nl FTZ-F1的表达量较对照极显著降低64.1%(P<0.01)。表型观察发现,NlCyp314a1表达量的下调导致了褐飞虱蜕皮困难,出现畸形虫体,第7天死亡率大于95%,且NlCyp314a1表达量的下调导致了褐飞虱卵巢发育畸形。【结论】褐飞虱蜕皮激素合成相关的Halloween基因在进化上非常保守,Halloween基因功能的研究揭示了褐飞虱体内Halloween基因对于褐飞虱蜕皮和繁殖的重要性。其表达水平的降低导致了褐飞虱生长发育和繁殖受阻,提示褐飞虱Halloween基因可用于褐飞虱蜕皮和繁殖进程的调控,同样也为Halloween基因在褐飞虱防治方面的潜在应用提供了依据。