摘要: 【目的】植食性刺吸式口器昆虫的唾液蛋白参与调控植物抗虫防御反应，影响其对寄主植物的适应性。本研究旨在通过克隆褐飞虱Nilaparvata lugens重要唾液蛋白基因Nl15,调查其时空表达模式，明确其在褐飞虱致害性中的作用。【方法】基于褐飞虱IR56种群转录组数据，用RT-PCR克隆褐飞虱基因Nl15 cDNA序列，并进行生物信息学分析。利用qPCR检测其在褐飞虱TN1和IR56种群不同发育阶段(卵、1-5龄若虫和雌雄成虫)和雌成虫不同组织(头、胸、腹和足)中的表达模式。通过显微注射dsRNA对褐飞虱TN1和IR56种群的4龄若虫进行Nl15的RNAi,利用qPCR检测Nl15 RNAi后褐飞虱若虫中Nl15的相对表达量以及Nl15 RNAi后褐飞虱若虫取食3 d时水稻植株中防御相关基因(OsLecRK4,OsMPK10,OsWRKY24,OsLox,OsNPR1和OsGns5)的相对表达量，并生物测定Nl15 RNAi后褐飞虱的存活率以及成虫蜜露量和体质量增量。【结果】克隆了褐飞虱Nl15 cDNA序列(GenBank登录号：OK181113),其开放阅读框长1 008 bp;预测编码335个氨基酸，理论等电点为7.54,分子量为38.7 kD,含有23个氨基酸的信号肽序列和一个糖基化修饰位点，不存在跨膜结构域和其他已知的功能域；Nl15与灰飞虱Laodelphax striatellus同源蛋白氨基酸序列一致性为45%。发育表达谱结果表明，Nl15在褐飞虱各个发育阶段均表达，在3-4龄若虫中的表达量最高；组织表达谱结果表明，Nl15在褐飞虱雌成虫头部中的表达量最高，且在IR56种群头部中的表达量高于在TN1种群头部中的。RNAi实验结果表明，与注射dsGFP的对照组相比，注射dsNl15的处理组中Nl15的表达量显著降低了89.5%,褐飞虱的存活率以及成虫蜜露量和体质量增量均显著降低，上述6个水稻防御相关基因的表达量显著上调。【结论】褐飞虱IR56种群中的Nl15参与褐飞虱与水稻的防御与反防御分子互作。本研究为进一步阐述褐飞虱克服抗虫基因的机制及揭示昆虫与植物互作的分子网络提供了思路。

摘要: 【目的】为探究保幼激素(juvenile hormone, JH)生物合成关键基因3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(HMGR)在白背飞虱Sogatella furcifera生殖中的作用。【方法】基于已公布的白背飞虱基因组和转录组数据,结合RT-PCR技术获得SfHMGR全长cDNA序列;采用RT-qPCR技术分析SfHMGR在白背飞虱不同发育阶段(1-5龄若虫和雌成虫)和雌成虫不同组织(头、肠道、脂肪体、卵巢和体壁)中的表达谱;通过RNAi技术靶向沉默SfHMGR后观察白背飞虱雌成虫卵巢的发育情况,统计单雌产卵量,用RT-qPCR测定JH生物合成下游基因SfJHAMT和SfFAMeT、JH信号传导相关基因SfMet和SfKr-h1以及卵巢发育关键基因SfVg和SfVgR的转录水平。【结果】克隆获得了白背飞虱SfHMGR(GenBank登录号:MW883397)的全长cDNA序列,开放阅读框长2 724 bp,编码907个氨基酸,其编码蛋白预测的分子量为98.96 kD,理论等电点为6.15。序列分析表明,SfHMGR含有典型的HMG-CoA还原酶的保守结构域、C端3个HMG-CoA结合位点、N端7个典型的跨膜结构域。系统进化分析发现,SfHMGR与灰飞虱Laodelphax striatella和褐飞虱Nilaparvata lugens的HMGR亲缘关系最近,氨基酸序列一致性分别达92.40%和89.25%。发育阶段表达谱结果表明,SfHMGR在各阶段发育中期以及初羽化雌虫中高表达;组织表达谱结果显示,SfHMGR在雌成虫各组织中均有表达,在肠道中具有最高的转录水平。通过显微注射dsRNA抑制SfHMGR表达后,显著抑制了雌虫的单雌产卵量和卵巢的发育,并且SfJHAMT,SfFAMeT,SfKr-h1,SfVg和SfVgR的转录水平也被显著抑制。【结论】SfHMGR通过影响JH生物合成过程及其JH的信号传导来调控SfVg的转录水平,进而影响白背飞虱雌虫的卵巢发育和产卵量。

摘要: 【目的】ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABC transporter)是一个庞大的膜转运蛋白超家族,在昆虫生长发育和抗药性方面具有重要作用。本研究旨在通过克隆白背飞虱Sogatella furcifera ABCD1基因,并测定其在杀虫剂胁迫下的表达模式,为后续的功能研究提供理论依据。【方法】采用RT-PCR技术克隆白背飞虱ABCD1基因cDNA序列并进行生物信息学分析;通过RT-qPCR技术测定其在白背飞虱不同发育时期(1-5龄若虫和羽化后第1-4天雌雄成虫)、5龄若虫和成虫的不同组织(头部、体壁、脂肪体、肠道、足、翅、精巢和卵巢)中及不同浓度(LC_(10), LC_(25), LC_(50)和LC_(90))噻虫嗪、噻嗪酮和阿维菌素胁迫下3龄若虫中的表达量。【结果】获得一个白背飞虱ABC转运蛋白基因,命名为SfABCD1(GenBank登录号:MW701394),其开放阅读框长2 220 bp,编码739个氨基酸,预测分子量为82.08 kD,理论等电点为9.32;SfABCD1与灰飞虱Laodelphax striatellus和褐飞虱Nilaparvata lugens的ABCD1亲缘关系较近。RT-qPCR结果表明,SfABCD1在5龄若虫中表达量最高,且在5龄若虫和成虫各组织中均有表达,在5龄若虫肠道和头部中表达量最高。3龄若虫受杀虫剂胁迫48 h后,与清水处理的对照组相比,噻嗪酮(LC_(10), LC_(50)和LC_(90)),噻虫嗪(LC_(10), LC_(25)和LC_(50))和阿维菌素(LC_(50)和LC_(90))处理组中的SfABCD1表达量均显著上调;LC_(10), LC_(25), LC_(50)和LC_(90) 4个浓度的3种杀虫剂处理不同时间后,SfABCD1的表达量在杀虫剂胁迫48 h时与对照差异最大,胁迫96 h时表达差异下降,处理120 h后该基因的表达水平接近对照组。【结论】白背飞虱可通过上调SfABCD1表达量来应对噻嗪酮和噻虫嗪的胁迫,SfABCD1表达量随噻虫嗪浓度的升高而降低;另外,白背飞虱也通过调节该基因的转录水平来响应高浓度阿维菌素的毒害。

摘要: 【目的】研究不同浓度氯化钙(calcium chloride, CaCl_2)浸种处理对水稻防御酶活性和抗褐飞虱Nilaparvata lugens的影响。【方法】分别用10, 20, 30, 40和50 mmol/L CaCl_2溶液浸泡水稻种子48 h,以蒸馏水浸种为对照,待水稻长至分蘖期时,检测褐飞虱3龄若虫取食胁迫下各浓度CaCl_2浸种处理水稻植株叶鞘苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)、过氧化物酶(peroxidase, POD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)和β-1, 3-葡聚糖酶(β-1,3 glucanase,β-1,3-GA)活性,以及褐飞虱2龄若虫取食不同浓度CaCl_2浸种处理水稻植株以及1 mmol/L钙离子螯合剂乙二醇四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid, EGTA)和离子通道抑制剂氯化镧(lanthanum chloride, LaCl_3)分别与20 mmol/L CaCl_2同时浸种处理植株7 d后的存活率。【结果】没有褐飞虱取食的情况下,各浓度CaCl_2浸种处理的水稻其叶鞘PAL, POD, PPO和β-1,3-GA酶活性与对照相比无显著差异;褐飞虱3龄若虫取食胁迫下,CaCl_2浸种处理的水稻植株以及对照植株叶鞘中以上4种防御酶的活性都显著升高,其中CaCl_2浸种处理水稻中的升高幅度大于对照水稻中的升高幅度,褐飞虱取食时不同浓度CaCl_2浸种对水稻植株叶鞘中各防御酶活性的影响不同,其中30 mmol/L CaCl_2浸种处理中PAL, POD和PPO酶活性分别比对照高104.88%, 94.32%和61.84%;10和20 mmol/L CaCl_2浸种处理中β-1,3-GA活性分别比对照高27.75%和33.04%。褐飞虱2龄若虫取食10, 20和30 mmol/L CaCl_2浸种处理的植株7 d后,存活率比取食对照植株的分别低32.68%, 22.54%和30.28%,但取食40和50 mmol/L CaCl_2浸种处理植株的褐飞虱若虫,其存活率与取食对照植株的相比无显著差异。此外,1 mmol/L钙离子螯合剂EGTA和离子通道抑制剂LaCl_3分别与20 mmol/L CaCl_2同时浸种处理水稻显著抑制20 mmol/L CaCl_2诱导的水稻对褐飞虱抗性的影响,取食EGTA+CaCl_2和LaCl_3+CaCl_2浸种处理水稻的褐飞虱若虫,其存活率分别比取食CaCl_2浸种处理的高25.80%和22.12%。【结论】通过浸种方式对水稻进行外源钙处理,可以使水稻植株进入防御警备状态,当其遭受褐飞虱取食为害时,会产生更高的防御酶活性,增强水稻对褐飞虱的抗性。

摘要: 【目的】昆虫感知外界营养状态,在体内营养信号通过许多信号通路进行传递,进而调控昆虫的生长和繁殖。本研究旨在为营养调控褐飞虱Nilaparvata lugens生长和繁殖的分子机制作出初步探索。【方法】在不同营养条件[100%浓度饲料(全纯人工饲料D-97,对照)、50%浓度人工饲料和25%浓度人工饲料]下饲喂褐飞虱3龄第2天若虫至成虫,统计体重、发育历期、存活率和每卵巢成熟卵量;利用荧光定量PCR检测羽化后第2天褐飞虱成虫不同组织(卵巢、脂肪体和其他组织)中IIS, TOR以及AMPK信号通路相关基因(InR1,InR2,AKT,FoxO,TOR,S6K,4EBP,AMPKα,AMPKβ和AMPKγ)的表达量;利用Western blot方法检测羽化后第6天褐飞虱成虫卵巢和其他组织中Akt, FoxO和AMPK蛋白磷酸化水平;同时检测羽化后第6天褐飞虱成虫不同组织中的ROS水平以及不同龄期褐飞虱体内保幼激素(juvenile hormone, JH)和蜕皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)滴度。【结果】与饲喂100%浓度人工饲料的对照相比,用低浓度人工饲料饲喂褐飞虱至成虫导致5龄第2天至成虫体重显著降低,从3龄第2天若虫至成虫发育历期缩短,死亡率提高,每卵巢成熟卵量显著降低。取食低浓度人工饲料后,羽化后第2天成虫IIS, TOR以及AMPK信号通路相关基因InR2,TOR,4EBP,AMPKα在卵巢、脂肪体和其他组织中,AKT,S6K和AMPKγ在脂肪体和其他组织中,以及InR1,FoxO和AMPKβ在其他组织中表达量较对照均显著下降,但卵巢中InR1,AKT,FoxO和AMPKγ的表达量相对稳定;羽化后第6天成虫卵巢和其他组织中AKT, FoxO以及AMPK的磷酸化水平显著增加。随着人工饲料饲喂浓度的降低,羽化后第6天褐飞虱成虫不同组织中的ROS水平显著增加。不同营养条件下褐飞虱4龄第2天若虫体内JH滴度无显著差异,低营养条件下5龄第2天若虫体内JH滴度较对照显著降低,而在羽化后第2天成虫体内JH滴度则较对照显著增加;低营养条件导致褐飞虱若虫以及成虫体内20E滴度均显著增加。【结论】褐飞虱在面临营养缺失的情况下,营养信号传导通路(IIS, TOR以及APMK通路)的关键基因表达均下降,而ROS水平显著上升,通过调节AKT, FoxO以及AMPK的磷酸化水平,进而影响JH以及20E的生物合成。