摘要: 用PCR方法扩增抗隐孢子虫子孢子ScFv片段,插入表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28-ScFv,然后,将绿脓杆菌外毒素(PE40)片段定向克隆到ScFv基因的下游,构建免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40。经酶切分析、PCR检测和测序进行鉴定。成功地构建了免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40。将上述质粒转化受体菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,成功地表达了目的蛋白。免疫毒素ScFv-PE40大小约为66kDa,表达量约占菌体蛋白总量的14%。

摘要: 应用RT PCR技术 ,从分泌抗隐孢子虫表膜单克隆抗体 (McAb)的杂交瘤细胞 4G4中 ,扩增出抗体VH 和VL 基因 ,用Linker (Gly4 Ser) 3基因 ,将VH 和VL 基因连接成ScFv基因 ,并将其克隆至pMD 18T载体中。经核甘酸序列分析证实 ,VH 和VL 基因及Linker基因拼接正确 ,基因全长 717bp ,经计算机分析 ,VH和VL 基因均为新发现的基因序列 ,符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征

摘要: 利用牛源微小隐孢子虫 (Cryptosporidiumparvum)超声粉碎物免疫BALB C小鼠 ,取脾细胞与SP2 0细胞融合 ,经 3～ 5次有限稀释克隆化 ,获得 4株持续分泌抗体的杂交瘤细胞株 ,分别命名为 1D5 ,2E9,3D6和 4G4。经检测 ,其分泌的抗体亚类 3株为IgG1,1株为IgM。通过免疫荧光鉴定 ,4株单抗均作用于子孢子抗原 ,其中 2株针对子孢子表膜。对杂交瘤细胞株的染色体计数 ,结果染色体均数为 90～ 98条。ELISA检测细胞培养上清效价分别为 1∶16 0 ,1∶32 0 ,1∶32 0和 1∶6 4 0 ,诱生小鼠腹水的抗体效价分别为 1∶4 0 9,6 0 0 ,1∶819,2 0 0 ,1∶819,2 0 0和 1∶1,6 38,4 0 0 ,特异性试验结果显示 ,4株单抗均不与贾第虫滋养体和结肠小袋纤毛虫发生交叉反应。

摘要: 分别从长春小白鼠、徐州人和南京黄牛的粪便中分离纯化了 3株微小隐孢子虫 (C .parvum)卵囊 ,根据C .parvum 18SrRNA基因序列设计合成引物 ,用PCR扩增卵囊基因组DNA ,其大小为 5 86bp的片段 ,PCR产物用试剂盒回收纯化后直接测序。将测得的序列用DNASTAR软件分析并与国外已发表的相应序列进行同源性比较 ,并绘制系统发育进化树。结果表明 ,徐州人源株与长春鼠源株及徐州人源株与南京黄牛源株同源性均为 97 6 % ;长春鼠源株与南京黄牛源株相应序列同源性为 99 6 %。此 3株C .parvum与国外株相应序列同源性为 81 4 %～ 10 0 0 %。限制性内切酶酶切位点分析仅发现徐州株有 1个特殊的DdeⅠ位点。本研究为人源及动物源微小隐孢子虫病诊断及人隐孢子虫感染来源和该病分子流行病学研究提供重要依据

摘要: 采用PCR技术从已构建的微小隐孢子虫cDNA文库中扩增含Apple结构域基因,构建pGEX-4T-1-Apple重组质粒,并进行原核表达及纯化,得到分子质量大小约为34 kDa的GST-Apple重组蛋白,以其为免疫原,免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,测定其免疫球蛋白亚类及效价,并用蛋白质印迹法(Western-blot)鉴定其特异性。结果共筛选出能稳定分泌抗重组Apple单克隆抗体的2株杂交瘤细胞株,抗体亚类均为IgG1,Western-blot分析显示2株单抗均能与重组蛋白GST-Apple发生特异性结合。为研究Apple结构域在隐孢子虫侵入过程中的功能提供有效工具。