摘要: 【目的】探析双叉犀金龟Trypoxylus dichotomus表皮蛋白的序列特征及生化性质。【方法】利用RT-PCR克隆双叉犀金龟表皮蛋白基因,利用生物信息学方法分析表皮蛋白的结构特征及系统发育;采用大肠杆菌Escherichia coli表达系统对双叉犀金龟表皮蛋白进行重组表达,并通过金属离子鳌合层析的方法对重组蛋白进行纯化;采用体外结合实验检测双叉犀金龟表皮蛋白与α-几丁质(α-chitin)、β-几丁质(β-chitin)、壳聚糖(chitosan)和胶体几丁质(colloidal chitin)的结合能力;观察确定蛋白液液相分离(liquid-liquid phase separation, LLPS)性质。【结果】克隆获得双叉犀金龟表皮蛋白基因TdCPR12611(GenBank登录号:MT813021)和TdCPR7854(GenBank登录号:MT813022)。系统进化分析结果表明,TdCPR12611与食粪金龟Onthophagus taurus OtCP-1的亲缘关系最近;TdCPR7854与食粪金龟的OtCP-acp20-1, OtCP-acp20-2和OtCP-acp20-3的亲缘关系最为接近,它们均属于CPR_RR-2家族。原核表达和纯化获得重组表皮蛋白TdCPR12611和TdCPR7854。两重组表皮蛋白与4种类型的几丁质具有不同结合能力,其中有41.4%的TdCPR12611与壳聚糖结合,而有62.3%的TdCPR7854与β-几丁质结合。TdCPR12611具有内部较为无序的结构,并能够在室温条件下自发团聚形成液液相分离现象,而TdCPR7854不能。【结论】本研究测定分析了双叉犀金龟CPR_RR-2家族表皮蛋白TdCPR12611与TdCPR7854的序列特征和与几丁质的结合特性。研究结果有利于加深人们对于昆虫表皮装配机制的了解,为蛋白仿生材料开发提供思路。

摘要: 【目的】东方绢金龟Maladera orientalis是我国重要的园林植物害虫。本研究通过鉴定对东方绢金龟具有引诱作用的桃树挥发物成分,为植物源引诱剂的开发奠定基础。【方法】利用顶空吸附法收集桃树枝叶挥发物,使用气质联用(GC-MS)及气相色谱触角电位(GC-EAD)鉴定桃树挥发物中对东方绢金龟雌成虫有电生理活性的物质组分;以正己烷为对照,使用触角电位(EAG)仪和Y型嗅觉仪分别测试东方绢金龟雌成虫对鉴定出的活性物质的EAG和行为反应。【结果】从桃树挥发物中共鉴定出6种活性物质,包括反-2-己烯醛、顺-3-己烯乙酸酯、反-3-己烯醇、顺-3-己烯醇、水杨酸甲酯以及1种未知化合物。当剂量为1和10μg时,东方绢金龟雌成虫对反-2-己烯醛的EAG反应值最大;当剂量为100μg时,东方绢金龟雌成虫对顺-3己烯乙酸酯的EAG反应值最小。行为反应试验结果表明,东方绢金龟雌成虫对100μg的反-3-己烯醇和顺-3-己烯醇表现出显著的趋性。【结论】桃树挥发物中的反-3-己烯醇和顺-3-己烯醇对东方绢金龟雌成虫有显著的吸引作用。

摘要: 【目的】橙带蓝尺蛾Milionia basalis近年来在我国南方地区严重危害罗汉松Podocarpus macrophyllus和竹柏Podocarpus nagi,扩散蔓延速度快,造成了很大的损失。本研究旨在评估金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae MaFZ-13菌株对橙带蓝尺蛾幼虫的致病力,探寻橙带蓝尺蛾生物防治新资源。【方法】通过绿僵菌MaFZ-13不同浓度(1.0×1051.0×109孢子/mL)孢子悬浮液接种橙带蓝尺蛾幼虫,运用时间-剂量-死亡率(TDM)模型对生物测定结果进行分析,同时通过林间喷施1.0×108孢子/mL绿僵菌孢子悬浮液进行林间防治效果试验。【结果】橙带蓝尺蛾幼虫累计死亡率随着绿僵菌MaFZ-13孢子悬浮液孢子浓度的增加和接种时间的延长而增大。接种1.0×109孢子/mL孢子悬浮液8 d后以及接种1.0×108孢子/mL孢子悬浮液10 d后,幼虫死亡率均达到100%;接种1.0×107孢子/mL孢子悬浮液15 d后幼虫死亡率为95.6%。应用TDM模型对生测数据进行分析,结果表明所建模型通过Hosmer-Lemeshow拟合异质性检验,并由模型估算出了该菌株对橙带蓝尺蛾幼虫的致死剂量和致死时间。绿僵菌MaFZ-13菌株接种4, 5, 6和7 d后的半致死剂量(LC_(50))对数估计值分别为7.99, 7.12, 6.46和5.83。以1.0×107, 1.0×108和1.0×109孢子/mL的孢子浓度接种时,绿僵菌MaFZ-13菌株对橙带蓝尺蛾幼虫的LT_(50)值分别为5.19, 3.99和2.81 d。林间用1.0×108孢子/mL绿僵菌孢子悬浮液喷洒9 d后橙带蓝尺蛾幼虫死亡率可达到85.8%,防治效果为85.05%。【结论】绿僵菌MaFZ-13对橙带蓝尺蛾幼虫具有较强的致病力,林间防治效果良好,具有较好的应用潜力。

摘要: 【目的】克隆和分析褐飞虱Nilaparvata lugens丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4,并探明其时空表达谱和病原真菌诱导表达模式。【方法】基于褐飞虱转录组和全基因组序列数据,利用PCR技术克隆得到褐飞虱Nlserpin4基因的全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其核苷酸和蛋白质序列特征;通过qRT-PCR技术检测其在褐飞虱不同发育时期(卵、1-5龄若虫和初羽化雌雄成虫)和5龄若虫不同组织(脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体)中的时空表达谱,以及金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae注射感染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式。【结果】克隆获得褐飞虱Nlserpin4基因全长cDNA序列(GenBank登录号:MN822802),其开放阅读框长1 227 bp,编码408个氨基酸,蛋白的相对分子质量和等电点分别为45.91 kD和6.23。氨基酸序列分析表明,Nlserpin4蛋白无糖基化位点,N端包含一段由23个氨基酸残基组成的信号肽,C端具有serpin蛋白家族典型的RCL区,且含有能被靶标蛋白酶识别的活性裂解位点。系统发育分析表明,Nlserpin4与半翅目其他昆虫的serpin亲缘关系较近,其中与蔗黄伪毛蚜Sipha flava serpin4的亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,Nlserpin4基因表达具有明显的时空特异性,其在成虫中的表达量显著高于在其他龄期的,且在雄成虫中表达量最高;Nlserpin4基因在褐飞虱5龄若虫脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体中均有表达,且在剩余虫体组织中表达量最高;病原真菌金龟子绿僵菌诱导48 h内Nlserpin4表达量均显著下调,但随着诱导时间的增加,Nlserpin4表达量呈回升趋势。【结论】褐飞虱Nlserpin4基因在褐飞虱不同发育阶段、不同组织以及病原真菌金龟子绿僵菌诱导不同时间下差异表达。研究结果为深入研究Nlserpin4在褐飞虱生长发育和免疫调节中的功能奠定了基础。

摘要: 【目的】筛选可有效引诱华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita成虫的引诱剂配方用于生态防控。【方法】选取5种植物挥发物、2种华北大黑鳃金龟聚集信息素和1种性信息素,根据各化合物单体最佳引诱浓度进行两两混配,得到植物挥发物+聚集信息素、植物挥发物+性信息素和聚集信息素+性信息素共17种二元引诱剂配方。通过触角电位(EAG)反应和趋性行为反应逐步筛选出引诱效果较好的配方。将所筛选配方与其单一组分通过趋性行为反应进行引诱效果比较,并通过室内笼罩诱捕检验配方对华北大黑鳃金龟成虫的引诱效果。【结果】通过EAG反应及趋性行为反应从17种二元引诱剂配方中逐步筛选出了对华北大黑鳃金龟成虫具有较强引诱作用的3种配方,即顺-3-己烯基乙酸酯+顺-9-十八烯乙酸酯,1-己醇+顺-9-十八烯乙酸酯和邻苯二甲酸二丁酯+甘氨酸甲酯,它们引起的华北大黑鳃金龟雌虫EAG反应相对值分别为5 981%, 5 796%和5 722%,引起的雄虫EAG反应相对值分别为3 983%, 4 712%和3 809%。趋性行为反应试验中,引起华北大黑鳃金龟成虫选择反应率最高的为配方邻苯二甲酸二丁酯+甘氨酸甲酯,成虫选择反应率达71.21%,其次为配方1-己醇+顺-9-十八烯乙酸酯和顺-3-己烯基乙酸酯+顺-9-十八烯乙酸酯,成虫选择反应率分别达到70.84%和70.72%,均显著高于其他配方引起的选择反应率。3种二元组分引诱剂配方与其单一组分引诱效果的比较表明,配方顺-3-己烯基乙酸酯+顺-9-十八烯乙酸酯对单一组分顺-3-己烯基乙酸酯具有显著的增效作用,而对顺-9-十八烯乙酸酯增效作用不明显;配方1-己醇+顺-9-十八烯乙酸酯和邻苯二甲酸二丁酯+甘氨酸甲酯均对其单一组分增效作用显著。室内笼罩诱捕结果表明,配方顺-3-己烯基乙酸酯+顺-9-十八烯乙酸酯,1-己醇+顺-9-十八烯乙酸酯和邻苯二甲酸二丁酯+甘氨酸甲酯引诱成虫数均极显著高于石蜡油对照,配方顺-3-己烯基乙酸酯+顺-9-十八烯乙酸酯引起的选择反应率最高,达74.06%;其次为配方1-己醇+顺-9-十八烯乙酸酯和邻苯二甲酸二丁酯+甘氨酸甲酯,引起的选择反应率分别达到65.89%和64.25%;但3种配方引起的华北大黑鳃金龟成虫的选择反应率之间无显著性差异。【结论】顺-3-己烯基乙酸酯+顺-9-十八烯乙酸酯,1-己醇+顺-9-十八烯乙酸酯和邻苯二甲酸二丁酯+甘氨酸甲酯这3种二元引诱剂配方对华北大黑鳃金龟成虫均具有较强的引诱作用,均可作为用于生态治理华北大黑鳃金龟的有效引诱剂。