摘要: 【目的】我们前期的研究发现,在灰飞虱Laodelphax striatellus抗毒死蜱品系、抗吡虫啉品系和抗溴氰菊酯品系中的总酯酶活力都明显升高。本研究旨在筛选导致总酯酶活力升高的酯酶基因并验证其在抗药性中的作用。【方法】通过转录组测序和RT-qPCR比较抗、感灰飞虱品系雌成虫中各个酯酶基因的表达量;采用显微注射技术建立超量表达灰飞虱羧酸酯酶基因的果蝇品系;并利用生物测定技术检测过量表达灰飞虱酯酶基因的果蝇对毒死蜱、吡虫啉和溴氰菊酯的敏感性。【结果】通过转录组数据和RT-q PCR筛选到羧酸酯酶基因LsCarE1(Gen Bank登录号:HM600723)在3个灰飞虱抗性品系中均过量表达。将LsCarE1基因按黑腹果蝇Drosophila melanogaster偏好的密码子优化后构建转基因载体质粒pUAST-att B-LsCarE1(Optimized),成功建立纯合的转基因果蝇品系UAS-LsCarE1(Optimized)。利用GAL4启动品系da-gal4与UAS-LsCarE1(Optimized)品系杂交,获得超量表达LsCarE1的果蝇品系da>LsCarE1(Optimized)。定量PCR检测发现,目标基因LsCarE1在超量表达品系da>LsCarE1(Optimized)中的表达量是对照品系UAS-LsCarE1(Optimized)中表达量的257.3倍;而另一对照品系da>gal4中没有检测到LsCarE1的表达。此外,黑腹果蝇内源的酯酶同源基因表达量显著低于目标基因的表达量。生物测定结果显示,与对照组da>gal4果蝇品系相比,启动超量表达LsCarE1的转基因果蝇da>LsCarE1(Optimized)对毒死蜱和吡虫啉的耐药性分别提高了4.19和2.46倍,但对溴氰菊酯的耐药性无显著变化。【结论】LsCarE1的过量表达与灰飞虱对毒死蜱和吡虫啉的抗性相关。

摘要: 阿尔茨海默症(Alzheimer's disease,AD),是一种以脑中β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)沉积为主要病理改变的神经退行性疾病。在果蝇Drosophila模型中建立淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的剪切通路模拟Aβ的产生过程,有望建立一种快速筛选治疗AD药物的动物模型。我们利用经典的Gal4/UAS系统,将现有的APP/BACE/DPsn果蝇品系连续杂交,通过同源重组的方法构建表达两个拷贝的APP/BACE/DPsn稳定可遗传的转基因果蝇新品系。进一步的实验结果表明:与不表达APP/BACE/DPsn的对照果蝇w/y;APP/Cyo;BACE-DPsn/TM6BTb相比,表达两拷贝APP/BACE/DPsn的w/y;elav-APP;BACE-DPsn果蝇的最长寿命为52d,比对照组(69d)缩短了17d,为对照组果蝇的75%;中位生存时间为39d,比对照组(49d)缩短了10d,为对照组的80%;平均寿命为37d,比对照组(47d)缩短了10d,为对照组的79%。同时,表达两个拷贝APP/BACE/DPsn的果蝇所产卵的羽化时间比对照果蝇延长了3d;其羽化成虫的理论值为1∶9(11%),而实际羽化率仅为5.2%。结果提示,由elav-Gal驱动在果蝇泛神经元内过表达APP/BACE/DPsn,可以缩短果蝇寿命、干扰果蝇胚胎正常发育。该果蝇有可能作为初步筛选AD治疗药物的动物模型,为AD治疗新药的发现提供工具。

摘要: 目的 建立UAS-Irk3-EGFP转基因果蝇品系，为转基因果蝇品系的构建与鉴定提供标准化流程，并为内向整流钾通道（inwardly rectifying potassium channel,Irk） 3基因的功能研究提供果蝇模型支撑，丰富国家果蝇资源。方法 利用PCR技术，从果蝇cDNA文库中扩增出Irk3基因的编码序列（coding sequences,CDS）。利用同源重组技术将其与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因一起克隆到pUASTattB载体中。通过显微注射技术，将获得的重组质粒注射入果蝇品系attP-25C6的胚胎中，利用红眼表型筛选能表达UAS-Irk3-EGFP的转基因红眼果蝇，然后通过与平衡子果蝇杂交进行背景纯化和平衡保种，最后通过PCR扩增和翅成虫盘免疫荧光染色方法鉴定其正确性。结果 构建了pUAST-attB-Irk3-EGFP重组质粒，并成功获得UAS-Irk3-EGFP转基因果蝇品系。PCR扩增结果证实，Irk3-EGFP基因序列已成功整合到转基因果蝇品系的基因组中。翅成虫盘免疫染色实验发现，翅囊区特异性表达的MS1096-GAL4驱动Irk3基因在翅成虫盘翅囊表达，后隔间特异性表达的hh-GAL4可驱动Irk3基因在翅成虫盘后隔间表达。结论 成功构建了UAS-Irk3-EGFP转基因果蝇品系，为应用半乳糖凝集素4(galectin-4,GAL4)/上游激活序列（upstream activating sequence,UAS）基因表达调控系统深入研究Irk3基因功能奠定了基础。