摘要: 为研究睾丸内注射外源DNA法生产转基因小鼠(Mus musculus)的可行性,并探讨注射DNA的最佳浓度。将环形的质粒DNA pEGFP-N1与脂质体混合制备DNA-脂质体复合物,按DNA浓度不同分为0.08μg/μl、0.12μg/μl和0.24μg/μl3组,分别注射入成年SPF级昆明小鼠睾丸内,同时设空白对照;每组处理公鼠2只,注射5d后每只与3只成年母鼠同笼,20d后在荧光显微镜下检测公鼠附睾精子,并制作睾丸石蜡切片,检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达;PCR法检测各组后代阳性率。结果显示,3组小鼠附睾荧光精子比例分别为9.09%、47.06%和27.78%。3组小鼠的睾丸石蜡切片中均可看到不同强度的GFP表达。后代经PCR检测阳性率分别为17.26%、47.61%和22.11%。本实验证实了睾丸注射法能使外源DNA整合进入精子基因组,并能在自身和后代中得到表达,本研究中外源DNA注射浓度以0.12μg/μl效果为最佳。

摘要: 为研究嵌合体动物中供体胚胎干细胞 (ES)在宿主胚胎发育中的走向和定位 ,同时探讨绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因在转基因动物制作中的应用价值 ,本研究将pEGFP N1基因导入小鼠ES D3 细胞系 ,得到稳定表达GFP的胚胎干细胞亚系ES D3 GFP ,通过对昆明小鼠的囊胚腔注射 ,获得了 4只表达绿色荧光蛋白的嵌合体小鼠。其中 1只存活至成年 ,3只出生时死亡。荧光显像及组织PCR检测显示了绿色荧光蛋白在小鼠体内的嵌合情况。以绿色荧光为指标可实现活体水平的动态观察 ,本实验首次观察到以GFP为指标所示的机体嵌合情况与根据毛色嵌合推测的机体嵌合情况存在很大差异 ,以GFP为嵌合指标更加全面而准确 ;但不排除GFP对小鼠发育存在一定毒性的可能 ;另外 ,有结果显示供体ES细胞在宿主体内除了大片补丁状嵌合外 ,还存在细胞散在嵌合的情况 ,后者提示了在组织中利用GFP对ES细胞实施单细胞追踪和实时观察的可行性 ,为胚胎发育和疾病发生的相关研究提供了新的观察方法

摘要: 应用荧光定量PCR技术对由位点控制区LCR的HS2元件和 β 珠蛋白基因启动子指导的红系特异表达绿色荧光蛋白 (GFP)基因的转基因小鼠中外源基因拷贝数进行测定 ,使用荧光显微镜和流式细胞仪检测小鼠外周血中GFP的表达水平 ,并运用荧光原位杂交技术 (FISH)确定了其中两只转基因小鼠中外源基因的整合位点 ,结果表明 :在转基因小鼠中外源基因的拷贝数各不相同且相差较大 ,而且拷贝数与GFP基因的表达量之间未呈现出相关性 ;FISH分析确定出两只转基因小鼠的外源基因整合于不同的染色体上 ;杂交信号的强弱与拷贝数的多少相一致

摘要: 将外源基因ＭＴＬＭＰ，ｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（Ｘ１）ＬＭＰ及ＨＬＡＤＲα分别注入昆明小鼠受精卵雄原核中，结果得到有这三种外源基因整合的三个转基因小鼠系，导入基因的整合率分别为８％，８０％及６６７％，它们的子一代（Ｆ１）及子二代（Ｆ２）基因组中也均有外源基因整合，并且导入ｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（Ｘ１）ＬＭＰ基因后经反转录聚合酶链式反应（ＲＴＰＣＲ），检测ｍＲＮＡ发现有该基因的表达，说明本法制备转基因小鼠是可行的。应用荧光原位杂交技术（ＦＩＳＨ），对子四代（Ｆ４）部分小鼠进行了整合定位研究，结果发现外源基因在体内为随机整合。本文对以上结果进行了讨论。

摘要: 显微注射法是制备转基因动物的首选方法 ,而原核清晰受精卵的获得是影响显微注射成败的关键。本文对小鼠HCG超排注射后大量原核期受精卵获得的最佳时间进行了研究 ,以提高显微注射成功率。结果显示采集雄性原核清晰受精卵的最佳时间段为注射HCG后 2 5～ 2 7h。