摘要: 【目的】本研究旨在通过对豌豆蚜Acyrthosiphon pisum内参基因在不同实验条件下的表达稳定性进行评估，为豌豆蚜基因表达分析奠定基础。【方法】利用qPCR测定昆虫常用14种候选内参基因(EF1α,Tubulin,NADH,RPL12,SDHB, 18S rRNA, 28S rRNA, 16S rRNA,ATPase,Actin,TATA,RPL32,GAPDH和RPL7)在豌豆蚜不同发育阶段(1-4龄若蚜和成蚜)、有翅和无翅孤雌成蚜、孤雌无翅成蚜不同组织(头、胸和腹)、不同地理种群(美国种群、甘肃种群、云南种群和德令哈种群)的孤雌无翅成蚜、不同寄主植物(苜蓿、三叶草和蚕豆)饲养的孤雌无翅成蚜、不同光周期(24L∶0D, 0L∶24D和16L∶8D)下饲养的孤雌无翅成蚜、不同温度(4, 18和35℃)下饲养的孤雌无翅成蚜和吡虫啉(200 g/L)处理下孤雌无翅成蚜中的表达量；利用RefFinder,ΔCt法，GeNorm, NormFinder和BestKeeper对上述14种内参基因表达稳定性进行分析；以CYP6CY3为靶标基因，探究不同内参基因对其在吡虫啉(200 g/L)处理下孤雌无翅成蚜中表达量分析的影响。【结果】依据qPCR检测结果，通过RefFinder对ΔCt法，GeNorm, NormFinder和BestKeeper结果的综合分析显示，在不同生物条件下(发育阶段、翅型、组织、地理种群和寄主植物),18S rRNA和GAPDH是表达最稳定的内参基因，而16S rRNA和Actin的表达稳定性最差。在非生物条件下(光周期、温度和杀虫剂),18S rRNA和EF1α的表达最稳定，而Tubulin和TATA的表达稳定性最差。基于GeNorm最佳内参基因数分析和不同内参基因对靶标基因CYP6CY3表达影响的分析，推荐使用2个表达最稳定内参基因18S rRNA和EF1α用于豌豆蚜的进一步研究。【结论】在豌豆蚜qPCR分析中，推荐同时使用18S rRNA和EF1α作为内参基因。

摘要: [目的]本研究旨在通过对豌豆蚜Acyrthosiphon pisum内参基因在不同条件下的表达稳定性进行评估,为豌豆蚜基因表达分析奠定基础。[方法]利用qPCR测定14种昆虫常用内参基因(EF1α,Tubulin,NADH,RPL12,SDHB,18S,28S,16S,v-ATPAase,Actin,TATA,RPL32,GAPDH和RPL7)在豌豆蚜不同发育阶段(1-4龄若蚜和成蚜)、有翅和无翅孤雌成蚜、孤雌无翅成蚜不同组织(头、胸和腹)、不同地理种群(美国种群、甘肃种群、云南种群和德令哈种群)的孤雌无翅成蚜、不同寄主植物(苜蓿,三叶草和蚕豆)饲养的孤雌无翅成蚜、不同光周期(24L:0D,0L:24D和16L:8D)下饲养的孤雌无翅成蚜、不同温度(4,18和35℃)下饲养的孤雌无翅成蚜和吡虫啉(200g/L)处理下孤雌无翅成蚜中的表达量;利用RefFinder,ΔCt法,Ge Norm,NormFinder和BestKeeper对上述14种内参基因表达稳定性进行分析;以CYP6CY3为靶标基因,探究不同内参基因对其在吡虫啉(200 g/L)处理下孤雌无翅成蚜中表达量分析的影响。[结果]依据qPCR检测结果,通过RefFinder对ΔCt法,GeNorm,NormFinder和BestKeeper结果的综合分析显示,在不同生物条件下(发育阶段、翅型、组织、地理种群和寄主植物),18S和GAPDH是表达最稳定的内参基因,而16S和Actin的表达稳定性最差。在非生物处理下(光周期、温度和杀虫剂),18S和EF1α的表达最稳定,而Tubulin和TATA的表达稳定性最差。基于GeNorm最佳内参基因数分析和不同内参基因对靶标基因CYP6CY3表达影响的分析,推荐同时使用2个表达最稳定内参基因18S和EF1α用于豌豆蚜的进一步研究。[结论]在豌豆蚜qPCR分析中,推荐同时使用18S和EF1α作为内参基因。

摘要: 【目的】本研究旨在鉴定豌豆蚜Acyrthosiphon pisum触角转录组中化学感受蛋白(chemosensory protein, CSP)基因，明确触角中高表达的豌豆蚜CSP蛋白与蚜虫报警信息素、性信息素以及植物挥发物的分子结合特性。【方法】通过对豌豆蚜成蚜触角进行转录组测序，鉴定触角中候选CSP基因；采用RPKM值和半定量RT-PCR分别明确这些CSP基因在豌豆蚜成蚜触角以及不同组织(触角、口针、去除触角和口针的头、胸、腹、足和翅)中的表达谱；通过荧光竞争结合实验测定这些触角CSPs与蚜虫报警信息素和性信息素以及植物挥发物的结合特性。【结果】在豌豆蚜成蚜触角转录组中鉴定得到10个CSP基因。RPKM值和半定量RT-PCR分析结果表明ApisCSP2,ApisCSP4和ApisCSP5在豌豆蚜成蚜触角中表达量最高。荧光竞争结合实验表明ApisCSP4与报警信息素主要组分(E)-β-法尼烯[(E)-β-farnesene, EβF]和微量组分(-)-α-蒎烯结合力强，K_i值分别为2.2±0.8和4.9±0.7μmol/L; ApisCSP5与两种性信息素组分(+)-(4aS,7S,7aR)-荆芥内酯和(-)-(1R,4aS,7S,7aR)-荆芥醇结合力强，K_i值分别为4.8±0.9和2.6±0.6μmol/L。【结论】豌豆蚜成蚜触角转录组中鉴定到10个CSP基因，其中ApisCSP4和ApisCSP5可能分别参与了蚜虫报警信息素和性信息素的转运。

摘要: 【目的】研究细菌-过氧化氢酶-豌豆蚜Acyrthosiphon pisum三者之间的关系,探索过氧化氢酶在豌豆蚜免疫防御反应中的作用。【方法】用体外培养结合菌落计数的方法检测藤黄微球菌Micrococcus luteus和大肠杆菌Escherichia coli感染豌豆蚜后在蚜虫体内的增殖;分别用微孔板荧光检测和实时定量PCR的方法检测藤黄微球菌和大肠杆菌感染豌豆蚜之后,蚜虫体内H_2O_2水平和过氧化氢酶基因的转录水平;通过RNA干扰技术对豌豆蚜过氧化氢酶基因(Cat)进行沉默,并检测沉默后感染藤黄微球菌和大肠杆菌的豌豆蚜体内H_2O_2浓度和细菌数目以及豌豆蚜存活率。【结果】藤黄微球菌感染12 h后,豌豆蚜体内H_2O_2水平以及过氧化氢酶基因表达水平显著升高;大肠杆菌感染12 h后,豌豆蚜过氧化氢酶基因表达水平上升,但H_2O_2水平无明显变化。沉默过氧化氢酶基因后,感染藤黄微球菌导致豌豆蚜体内H_2O_2含量在12 h显著上升,细菌数目在24 h约为对照组的一半,但对豌豆蚜存活率无影响;而过氧化氢酶基因沉默并未引起感染大肠杆菌的豌豆蚜体内H_2O_2水平、细菌数目以及豌豆蚜存活率发生明显变化。【结论】过氧化氢酶参与豌豆蚜对藤黄微球菌的防御过程,但不是该防御反应过程中的关键酶;而针对大肠杆菌感染,豌豆蚜可能通过其他途径来应对。

摘要: 【目的】本研究旨在揭示豌豆蚜Acyrthosiphon pisum体内过氧化物氧化还原酶2(ApPrx2)在豌豆蚜应对细菌感染中的作用。【方法】克隆并在大肠杆菌Escherichia coli中异源表达ApPrx2的开放阅读框;对重组蛋白的抗氧化活性进行鉴定;测定绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus感染豌豆蚜后豌豆蚜体内H_2O_2浓度和ApPrx2的转录水平;通过RNA干扰降低ApPrx2的表达;降低ApPrx2的表达后检测豌豆蚜体内H_2O_2浓度、细菌数目和豌豆蚜的存活率。【结果】序列比对结果表明,ApPrx2与其他物种2-Cys Prxs具有较高的相似性。重组表达的ApPrx2蛋白能够有效降解H_2O_2,表达ApPrx2蛋白的大肠杆菌E.coli对H_2O_2的抗性更高。绿脓杆菌P.aeruginosa和金黄色葡萄球菌S.aureus感染引起豌豆蚜体内H_2O_2水平及ApPrx2转录水平的升高。通过RNA干扰降低ApPrx2表达之后,金黄色葡萄球菌感染的蚜虫体内的H_2O_2水平显著上升,其体内的细菌数显著低于对照,蚜虫的存活率显著降低。【结论】ApPrx2作为抗氧化蛋白能够帮助豌豆蚜抵御因细菌特别是金黄色葡萄球菌感染引起的氧化胁迫。