摘要: 【目的】Piwi蛋白互作RNA(PIWI-interacting RNA, piRNA)在昆虫的发育和免疫等重要生物学过程发挥重要的调控作用。本研究旨在丰富西方蜜蜂Apis mellifera的piRNA信息，并为进一步探究差异表达piRNA(differentially expressed piRNA, DEpiRNA)调控意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂中肠发育的分子机理提供基础。【方法】基于已获得的意大利蜜蜂7日龄(Am7)和10日龄(Am10)工蜂中肠的small RNA(sRNA)组学数据，对piRNA进行预测和分析。将质控后的sRNA数据比对西方蜜蜂参考基因组，再将比对上的序列标签(tags)进一步比对数据库以滤除rRNA和tRNA等小非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA),进而根据piRNA的长度特征鉴定piRNA。采用TPM(tags per million)算法对piRNA表达量进行计算和归一化处理。根据|log_2 fold change|≥1且P≤0.05的标准筛选Am7 vs Am10比较组的DEpiRNA。通过相关软件预测DEpiRNA的靶mRNA并进行GO和KEGG数据库注释。利用Cytoscape软件对DEpiRNA-mRNA调控网络进行可视化。通过Stem-loop RT-PCR对随机选取的Am7与Am10两组共有的6个piRNA的表达进行验证。利用RT-qPCR对随机挑选的6个DEpiRNA的表达趋势进行验证。【结果】从意大利蜜蜂工蜂中肠中共鉴定到596个piRNA,长度介于2433 nt,且Am7和Am10组中不同长度分布范围的piRNA的首位碱基偏向性具有明显差异。在Am7 vs Am10比较组共筛选出41个DEpiRNA,其中piR-ame-11093, piR-ame-1111451, piR-ame-190949和piR-ame-932156可分别靶向1 195, 1 018, 4 040和1 063条mRNA。上述靶mRNA可分别注释到45个功能条目和45条通路。Stem-loop RT-PCR验证结果显示6个piRNA (piR-ame-1084826, piR-ame-11093, piR-ame-14476, piR-ame-24995, piR-ame-39500和piR-ame-774987)均真实表达。RT-qPCR结果显示共有6个DEpiRNA (piR-ame-1084826, piR-ame-11093, piR-ame-14476, piR-ame-24995, piR-ame-39500和piR-ame-774987)的表达趋势与测序数据中的表达趋势一致，证实了本研究中sRNA-seq数据的可靠性和piRNA差异表达趋势的真实性。【结论】本研究从意大利蜜蜂工蜂中肠中鉴定到596个piRNA,长度介于2433 nt。不同长度分布范围的piRNA的首位碱基偏向性具有明显差异；piR-ame-11093, piR-ame-1111451, piR-ame-190949和piR-ame-932156具有靶向调控基因表达参与工蜂中肠发育过程的潜力。

摘要: 【目的】本研究旨在从转录组水平筛选和分析西方蜜蜂Apis mellifera工蜂不同时期蛹对低温胁迫反应的差异表达基因(DEGs)。【方法】将西方蜜蜂工蜂封盖后3 d预蛹以及封盖后6和9 d蛹分别置于低温环境(20℃)和最适发育温度(35℃)中4 h,分别作为处理组和对照组，通过转录组学技术筛选低温处理组与对应的对照组之间的DEGs,并进行GO功能分类和KEGG通路分析。利用RT-qPCR分别对封盖后3 d预蛹以及封盖后6和9 d蛹的8, 6和5个DEGs的表达谱进行验证。【结果】与对照组相比，封盖后3 d预蛹以及封盖后6和9 d蛹受低温胁迫后的DEGs分别有220, 50和26个；GO功能分类发现，DEGs富集数最多的条目为代谢进程、细胞进程、催化活性和结合，封盖后3 d预蛹的DEGs在生物学进程调控、细胞部分和细胞器等有较多富集。KEGG通路分析显示，处理组和对照组间西方蜜蜂各日龄DEGs在整体概述图、氨基酸代谢、信号转导、运输和分解代谢有富集。封盖后3 d预蛹以及封盖后6和9 d蛹受低温胁迫后共有的DEG 3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1基因PDK1上调表达，同时富集在自噬-动物、mTOR和FoxO信号通路。低温胁迫后，封盖后3 d预蛹的胰岛素受体底物1-B基因IRS1-B和Kruppel同源物1基因Kr-h1上调表达，而核激素受体FTZ-F1基因Ftz-F1与蜕皮启动激素基因Eth显著下调表达，说明封盖后3 d预蛹响应低温细胞自噬和蜕皮受到抑制程度更大。在低温胁迫后封盖后6 d蛹中与昆虫角质层着色与免疫相关的酪氨酸羟化酶基因TyHyd下调表达；与对照组相比，在低温胁迫后封盖后9 d蛹中DEGs最少，说明在3个蛹期中，其受低温的影响较小。【结论】本研究测定了西方蜜蜂3个不同发育阶段蛹响应低温的DEGs,结果显示大部分DEGs为阶段特有，说明西方蜜蜂不同发育阶段响应低温的机制不同。一些共有DEGs以及阶段特有DEGs的功能研究和其作用机制是进一步研究蜜蜂对低温响应机制的重点内容，为探究蜜蜂蛹期响应低温胁迫的分子机制提供了基础数据。

摘要: 【目的】本实验旨在研究3个低浓度氟胺氰菊酯对西方蜜蜂Apis mellifera育王质量的影响。【方法】控制蜂王产卵8 h,孵化后进行人工育王,从移虫第2天起每天用微量进样器分别给王台中小幼虫饲喂2μL含有0.05,0.5和5 mg/kg氟胺氰菊酯的糖水,以饲喂纯糖水作为对照组并进行标记。连续饲喂3 d后,记录王台的封盖数,待蜂王出房时,统计出房数,测其初生重、胸宽;利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测蜂王卵巢中卵黄蛋白原基因(Vg)、储存蛋白基因(hex110和hex70b)的相对表达量。【结果】5 mg/kg氟胺氰菊酯处理组王台封盖率显著低于0.05和0.5 mg/kg剂量组及对照组,但后3组之间差异不显著;5 mg/kg和0.5 mg/kg剂量组蜂王出房率显著低于0.05 mg/kg剂量组及对照组;4个试验组之间蜂王初生重及胸宽差异不显著。qPCR结果显示,5mg/kg剂量组蜂王卵巢中Vg和hex110基因的相对表达量均显著低于0.05和0.5 mg/kg剂量组及对照组,但后3组之间差异不显著;0.5 mg/kg剂量组和5 mg/kg剂量组蜂王卵巢hex70b基因相对表达量显著低于对照组,但0.05 mg/kg剂量组蜂王卵巢hex70b基因相对表达量与0.5和5 mg/kg剂量组及对照组均差异不显著。【结论】本研究结果说明,食物中氟胺氰菊酯含量超过0.5 mg/kg时,会影响西方蜜蜂育王培育质量。

摘要: 【目的】RBP1是一种参与黑腹果蝇Drosophila melanogaster性别决定基因doublesex(dsx)premRNA选择性剪接的重要剪接因子。本研究旨在克隆RBP1基因在西方蜜蜂Apis mellifera中的同源基因AmRBP1,分析其结构域及其在西方蜜蜂性别决定初期胚胎和幼虫不同发育阶段中的表达模式,以期为研究该基因是否参与蜜蜂性别决定奠定基础。【方法】基于NCBI中提交的西方蜜蜂基因数据库和转录组数据库,利用黑腹果蝇rbp1对数据库进行同源检索获得RBP1的转录组序列,并设计引物进行PCR扩增克隆AmRBP1基因,利用生物信息学软件对其进行核酸及氨基酸序列分析。采用半定量RT-PCR技术分析该基因在西方蜜蜂胚胎及幼虫期的表达模式。【结果】由序列比对分析可知,西方蜜蜂AmRBP1基因的pre-mRNA含有3种不同的选择性剪切形式。通过设计不同的引物,克隆得到3种成熟的mRNA序列,分别命名为AmRBP1-R1(Gen Bank登录号:KY404154)、AmRBP1-R2(Gen Bank登录号:KY404155)和AmRBP1-R3(Gen Bank登录号:KY404156);mRNA长度分别为696,790和771 nt,编码的蛋白大小分别为130,166和162 aa;结构域分析发现AmRBP1的3种选择性剪切形式具有相同的结构域,氨基端含有一个RRM结构域,羧基端含有一个RS结构域。同源性分析表明,西方蜜蜂AmRBP1与丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis、红火蚁Solenopsis invicta、埃及伊蚊Aedes aegypti、黑腹果蝇D.melanogaster、家蚕Bombyx mori、家蝇Musca domestica和中华按蚊Anopheles sinensis RBP1蛋白氨基酸序列一致性分别为96.97%,94.20%,84.85%,81.48%,80.28%,78.15%和69.23%。半定量RT-PCR结果表明,AmRBP1基因的3种剪切形式(AmRBP1-R1-3)在西方蜜蜂胚胎和幼虫各时期均有表达,无雌特异性或雄特异性表达的剪切形式。【结论】西方蜜蜂AmRBP1可能是一种SR家族剪切因子,其有可能参与调控基因表达的特定剪切,但其是否参与doublesex(dsx)基因pre-mRNA的性别特异性剪切需要进一步研究。

摘要: 【目的】探讨移虫龄期对西方蜜蜂Apis mellifera蜂王卵巢发育的分子调控机制。【方法】运用相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)技术对不同龄期移虫培育的蜂王卵巢组织蛋白质进行定量分析,筛选差异表达蛋白。利用蛋白质免疫印迹法对结果进行验证。【结果】iTRAQ定量分析共鉴定到蜂王卵巢组织蛋白质二级图谱452 966个,最终获得3 642个蛋白。GO(Gene Ontology)富集结果表明,不同龄期移虫发育的蜂王卵巢组织差异表达蛋白主要富集在细胞代谢、分裂以及蛋白质合成。Pathway富集分析表明,1龄幼虫期移虫和2龄幼虫期移虫发育的蜂王卵巢组织差异表达蛋白主要富集在碳水化合物代谢、脂代谢和外源降解类群;1龄幼虫期移虫和3龄幼虫期移虫发育蜂王卵巢组织差异蛋白主要富集在有机体发育通路、核糖体通路和溶酶体代谢。与此同时,两个差异表达蛋白即储存蛋白Hexamerin110和Hexamerin70b的蛋白免疫印迹检测结果表明,随着移虫龄期的增加,Hexamerin110和Hexamerin70b的表达量均呈现降低的趋势。【结论】对不同龄期移虫的蜂王之间差异表达蛋白进行鉴定,为进一步研究蜂王生殖发育及级型分化的调控机制提供理论依据。