摘要: 【目的】近年来随着交通条件的改善,每年有大量西方蜜蜂Apis mellifera蜂场从全国各地赶到云南放蜂。本研究旨在揭示西方蜜蜂这一外来蜂种对云南本地传粉蜂种类、数量及其物种多样性的影响。【方法】采用马来氏网收集、调查了云南省罗平县西方蜜蜂高放蜂密度试验点(鲁特和走马田)、中放蜂密度试验点(外纳和下阿列)和低放蜂密度试验点(马把和下庄科)共6个试验点包括山林生境和农田生境的本地传粉蜂群落结构;并对比分析了不同放蜂密度、不同生境下各试验点传粉蜂物种多样性指数(H′)、均匀度指数(J′)及丰富度指数(Dm)之间的差异。【结果】采集到的1 715头本地传粉蜂隶属于10科53种,其中蜜蜂科(Apidae)、隧蜂科(Halictidae)和胡蜂科(Vespidae)为优势类群,东方蜜蜂Apis cerana和切淡脉隧蜂Lasioglossum excisum为优势种。在放蜂密度(试验点周围3 km范围内西方蜜蜂蜂群数量)为7232 750群这一变动范围内,各试验点本地传粉蜂物种数量、个体数量均随西方蜜蜂放蜂密度的增大而减少,物种多样性指数(H′)及丰富度指数(Dm)也相应降低,但西方蜜蜂放蜂密度对本地传粉蜂均匀度指数(J′)没有影响。此外,在相同放蜂密度下,山林生境的本地传粉蜂物种多样性均显著高于农田生境。【结论】云南罗平本地传粉蜂的群落结构及物种多样性受西方蜜蜂放蜂密度的影响,在放蜂密度从7232 750群这一变动范围内,放蜂密度越大,本地传粉蜂的个体数、物种数、多样性指数和丰富度指数越小。本研究结果为进一步研究合理控制西方蜜蜂放蜂密度以保护云南本地传粉蜂种的多样性提供了思路。

摘要: 【目的】本实验旨在研究王台中残留啶虫脒对西方蜜蜂Apis mellifera蜂王培育质量的影响。【方法】通过融化蜂蜡并添加啶虫脒药液制作王台,使各王台中分别含4个不同剂量的啶虫脒(0, 10, 100和1 000μg/kg蜂蜡)。同时,控制蜂王产卵6 h, 3 d后,将孵化为1日龄的幼虫分别移入各组王台中,并放入蜂群哺育。移虫后第3和6天分别统计各组王台中幼虫的接受率和封盖率,待蜂王出房时,计算其出房率,测定蜂王个体初生重、胸重和胸宽指标;采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术测定蜂王卵巢中卵黄原蛋白基因(Vg)、储存蛋白基因(hex110和hex70b)的相对表达量。【结果】100μg/kg蜂蜡和1 000μg/kg蜂蜡这两个啶虫脒剂量组西方蜜蜂蜂王的出房率都显著低于0μg/kg蜂蜡和10μg/kg蜂蜡剂量组,而0μg/kg蜂蜡与10μg/kg蜂蜡剂量组之间及100μg/kg蜂蜡与1 000μg/kg蜂蜡剂量组之间出房率均差异不显著;这4个剂量组的王台幼虫接受率和封盖率以及蜂王的初生重、胸重和胸宽均无显著差异。qPCR结果显示,Vg基因的相对表达量随啶虫脒浓度的增加而下降,其中,1 000μg/kg蜂蜡剂量组Vg基因的相对表达量显著低于10μg/kg蜂蜡剂量组和0μg/kg蜂蜡剂量组,其余各剂量组之间差异不显著;这4个剂量组之间hex110和hex70b基因的表达量差异不显著。【结论】西方蜜蜂王台中啶虫脒残留超过100μg/kg蜂蜡剂量时,会对蜂王培育产生不利影响。

摘要: 【目的】以西方蜜蜂Apis mellifera工蜂肠道为例探究组织透明化技术——丙烯酰胺交联替换脂质透明硬化成像/免疫染色/原位杂交兼容组织水凝胶(clear lipid-exchanged acrylamide-hybridized rigid imaging/immunostaining/in situ hybridization-compatible tissue-hYdrogel, CLARITY)在昆虫组织上的应用,确定CLARITY与荧光原位杂交(FISH)相结合在昆虫肠道组织透明化中的适用性。【方法】依照CLARITY技术操作程序,用水凝胶固定西方蜜蜂肠道,并以被动方式透明化,再用靶向东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae 16S rRNA带异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记和靶向真核细胞18S rRNA带Texas RED标记的寡核苷酸荧光探针进行肠道组织的荧光原位杂交,然后用DAPI(蓝色)进行细胞核复染,通过激光共聚焦显微镜观察透明化的染色组织。【结果】首次成功将西方蜜蜂肠道组织透明化。在激光共聚焦显微镜下,观察到马氏管的原始分布形态,以及东方蜜蜂微孢子虫在中肠末端分布更密集的空间分布特征,并实现了对肠道组织的3D重构。【结论】CLARITY能应用于蜜蜂肠道组织透明化,透明化组织能进行原位杂交和激光共聚焦观察。CLARITY和FISH相结合免除抗体制备和石蜡切片的麻烦,直观展示肠道内部的真实状态,为昆虫生理病理研究提供了一种可靠特异的标记方法。

摘要: [目的]Argonaute (AGO)家族是一类在进化上高度保守的蛋白家族,其在真核生物中主要参与形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),进而通过沉默基因表达参与诸多生物学过程。蜜蜂AGO蛋白的相关研究迄今仍然缺失。本研究拟通过预测西方蜜蜂Apis mellifera的AGO1(AmAGO1)理化性质和分子特性,解析AmAGO1在西方蜜蜂中的时空表达谱,并制备AmAGO1的多克隆抗体,为深入开展AmAGO1的功能与机制研究提供参考和基础。[方法]PCR扩增西方蜜蜂AmAGO1的编码序列(coding sequence,CDS);通过生物信息学预测AmAGO1蛋白的理化性质和分子特性;利用RT-qPCR检测AmAGO1在西方蜜蜂工蜂卵、3日龄幼虫、7日龄预蛹、8日龄预蛹、12日龄蛹以及1,2,6,12,15和18日龄成虫以及工蜂成虫触角、咽下腺、脑、表皮、中肠、脂肪体和毒腺中的表达量;构建原核表达质粒后诱导表达AmAGO1融合蛋白,并鉴定其表达形式;制备AmAGO1多克隆抗体,利用ELISA,Western blot和免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)分别检测抗体效价、灵敏度和特异性。[结果]成功克隆到西方蜜蜂AmAGO1的CDS;AmAGO1含928个氨基酸,分子式为C_(4624) H_(7332) N_(1316) O_(1325) S_(51),分子量约为104.2 kD,等电点为9.31,平均亲水系数为-0.2965,含86个磷酸化位点及典型的PAZ结构域和PIWI结构域,但不存在典型的信号肽;AGO1在智人Homo sapiens、斑马鱼Danio rerio、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、家蚕Bombyx mori、西方蜜蜂、东方蜜蜂A.cerana和欧洲熊蜂Bombus terrestris中具有较高的序列一致性;西方蜜蜂和东方蜜蜂的AGO1聚为一支,同源性最高。AmAGO1在西方蜜蜂工蜂卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫中均有表达但表达量存在差异,3日龄幼虫和7日龄预蛹中AmAGO1的表达量显著低于卵中的表达量,而8日龄预蛹和12日龄蛹中AmAGO1的表达量显著高于卵中的表达量;AmAGO1在1,2,6,12,15和18日龄工蜂体内均有表达但表达量也存在差异,其中1日龄成虫体内AmAGO1的表达量显著高于其他日龄成虫体内的表达量;AmAGO1在工蜂成虫触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮中均有表达但表达量存在差异,触角中AmAGO1的表达量与咽下腺中的相差无几,但二者均显著高于毒腺、脑、中肠、脂肪体和表皮中AmAGO1的表达量;AmAGO1融合蛋白的表达形式为包涵体;制备的AmAGO1多克隆抗体具有较高的效价、灵敏度和特异性。[结论]AmAGO1可能是亲水性胞内蛋白,含有典型的PAZ结构域和PIWI结构域;AmAGO1在西方蜜蜂工蜂不同组织和不同发育阶段发挥潜在的重要功能;成功制备出高效价、高灵敏度和强特异性的AGO1多克隆抗体。

摘要: 【目的】本研究旨在克隆西方蜜蜂Apis mellifera RNA m6A甲基转移酶14 (methyltransferase 14, METTL14)基因AmMETTL14,分析AmMETTL14的理化性质和分子特性以及AmMETTL14在工蜂不同发育阶段和不同组织中的表达模式，并制备AmMETTL14多克隆抗体，为持续深入开展AmMETTL14的功能研究提供参考和基础。【方法】通过PCR扩增西方蜜蜂AmMETTL14的CDS并进行Sanger测序验证。使用相关生物信息学软件对AmMETTL14进行生物信息学分析，并构建系统进化树。通过原核表达系统诱导表达AmMETTL14融合蛋白，免疫新西兰白兔以制备多克隆抗体，利用ELISA和Western blot分别检测抗体的效价及特异性。采用RT-qPCR检测AmMETTL14在卵、幼虫、预蛹、蛹及工蜂成虫中以及刚出房工蜂成虫的触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮7种组织中的相对表达量。【结果】成功克隆到西方蜜蜂AmMETTL14的CDS;AmMETTL14的分子式为C_(1957)H_(3113)N_(567)O_(589)S_(15),分子量约为44.49 kD,脂溶系数为79.97,理论等电点为8.58,平均亲水系数为-0.59,不含典型的跨膜结构域和信号肽，可同时定位于细胞核、线粒体和细胞质；西方蜜蜂、中华蜜蜂A.cerana cerana、黑大蜜蜂A.laboriosa、东方蜜蜂A.cerana、大蜜蜂A.dorsata、小蜜蜂A.florea、欧洲熊蜂Bombus terrestris、金环胡蜂Vespa mandarinia、美洲东部熊蜂B.impatiens和黑腹果蝇Drosophila melanogaster的METTL14均含有MT-A70结构域和3个相同的保守基序；AmMETTL14与黑大蜜蜂的METTL14的氨基酸序列一致性最高(65.60%)且亲缘关系最近。制备的AmMETTL14多克隆抗体效价较高(大于512 K)且特异性较强。AmMETTL14在7和8日龄预蛹与卵中的表达量相近且均显著高于在3日龄幼虫中的表达量，在12日龄蛹中的表达量显著高于卵、幼虫和预蛹中的表达量，在6, 12和15日龄工蜂成虫体内的表达量显著高于1日龄工蜂成虫体内的表达量；AmMETTL14在刚出房工蜂成虫脑和咽下腺中的表达量与触角中的表达量相近且均显著高于在毒腺、中肠、脂肪体和表皮中的表达量。【结论】研究结果表明，AmMETTL14可能为亲水性、非跨膜和胞内蛋白，AmMETTL14在幼虫生长发育中发挥潜在的调控作用，制备得到的AmMETTL14的多克隆抗体效价高、灵敏度高和特异性强，为进一步探究AmMETTL14的功能及其参与的表观调控机制打下了基础。