摘要: 【目的】细胞色素P450单加氧酶在昆虫生长发育和适应环境过程中发挥着重要功能。【方法】本研究克隆了褐飞虱Nilaparvata lugens细胞色素P450基因CYP4C62的开放阅读框(不含信号肽编码序列部分),在大肠杆菌Escherichia coli中实现了高效表达,经Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化得到了重组的CYP4C62蛋白。将该蛋白免疫日本大耳白兔Oryctolagus cuniculus雄兔,制备了兔抗CYP4C62血清抗体。采用间接ELISA方法检测了血清抗体的效价;并通过Western印迹杂交检测了该抗体的免疫学特异性。【结果】结果表明,通过大肠杆菌表达出的CYP4C62蛋白相对分子量为56 kD。间接ELISA法检测表明,制备的兔抗CYP4C62抗体的效价达到1∶100 000。Western印迹杂交证实,该抗体既可与异源表达的CYP4C62蛋白特异性结合,也可以与褐飞虱总蛋白中内源的CYP4C62特异性结合,表明具有较好的免疫反应特异性。【结论】CYP4C62多克隆抗体的成功制备,为后续分析CYP4C62在褐飞虱各组织中的时空表达水平,并通过免疫组织化学法定位分析该蛋白的组织、细胞及亚细胞分布规律,及最终解析CYP4C62的生物学功能奠定了基础。

摘要: 褐飞虱Nilaparvata lugens(Stl)是一种危害水稻的重要害虫,在取食水稻时其唾液腺分泌的一些物质能激发水稻产生一系列生理生化反应。为了从褐飞虱唾液腺中得到编码这些分泌物的基因,本研究运用抑制差减杂交法(suppressed subtractive hybridization,SSH)和镜像选择(mirror orientation selection,MOS)法,分别以取食抗虫水稻B5和敏感水稻TN1的褐飞虱唾液腺cDNA为tester和driver,构建了一个含有768个克隆子的抑制差减杂交文库。经筛选得到102个EST,插入序列长2501 000 bp,代表35个单基因。其中28个表达上调,7个表达下调。经GenBank里的blastx在线分析工具分析,除了约1/3的转录序列没有相匹配的蛋白质外,其他EST所代表的氨基酸序列与已知蛋白存在不同程度的相似度,如海藻溏酶、卵黄蛋白原、Ca2+结合蛋白、组织蛋白酶B(cathepsin B)、黏液样蛋白(putative mucin-like protein)、羧酸酯酶(carboxylesterase)和碳酸酐酶(cah-3 carbonic anhydrase)等,且多数蛋白含有信号肽,推测与分泌有关。本研究将为进一步研究刺吸式昆虫中的激发子蛋白奠定了一定的基础。

摘要: 表皮蛋白与几丁质结合构成抵御外界不良环境的昆虫角质层,在昆虫的生长发育及蜕皮硬化中具有重要的作用。为了探讨表皮蛋白基因在褐飞虱Nilaparvata lugens生长发育中的功能,本研究根据褐飞虱转录组测序信息,对其中1个预测为编码表皮蛋白的Unigene36450序列进行了克隆,并应用荧光定量PCR和RNA干扰(RNAi)技术分别对该基因的表达规律和功能进行了研究。结果表明:克隆的Unigene36450全长cDNA开放阅读框长585bp,编码的蛋白含194个氨基酸,具有典型的表皮蛋白R&R保守结构域,命名为NlICP。转录水平的时序表达分析发现,NlICP仅在褐飞虱若虫期表达,且在3龄若虫体内表达量最高,提示该基因编码的蛋白属于幼虫表皮蛋白。RNA干扰结果显示,取食dsNlICP的1龄末2龄初(孵化后第3天)若虫在干扰6 d和8 d时,NlICP基因的表达量分别较取食dsGFP的对照组下降58.8%和45.6%,差异极显著(P<0.01);干扰后部分褐飞虱若虫因蜕皮不完全死亡,干扰5 d的存活率较对照下降26.7%。本研究结果提示,NlICP与褐飞虱若虫的生长发育及蜕皮相关,可以作为褐飞虱防治的潜在靶标基因。

摘要: 【目的】筛选与褐飞虱Nilaparvata lugens中肠内膜相结合的短肽,探索能阻断褐飞虱传播水稻病毒的新方法。【方法】通过改良的膜饲喂法和噬菌体短肽文库展示技术,模拟褐飞虱正常取食的行为,筛选能够与其中肠内膜结合的短肽。将筛选到的短肽与加强绿色荧光蛋白进行融合表达,经纯化后,将融合蛋白饲喂给褐飞虱若虫,通过荧光显微镜观察饲喂后若虫的中肠。【结果】使用改良的膜饲喂法,16h后褐飞虱若虫的取食率达到91%,24h后达到95%。经形态学验证,确定了一种短肽与褐飞虱中肠内膜具有结合活性,并将其命名为P2S。【结论】改良了针对褐飞虱的膜饲喂法,筛选并验证了能够与褐飞虱中肠内膜结合的活性短肽P2S。研究结果为阻断相关的水稻病毒与褐飞虱中肠内膜间的相互作用研究提供了科学依据,也为褐飞虱新型膜穿孔毒素蛋白的研究提供了理论基础。

摘要: 为了探知基因组甲基化是否参与了昆虫抗药性,本研究在室内对褐飞虱Nilaparva talugens连续9个世代的3龄若虫施用吡虫啉,用AFLP检测褐飞虱抗性产生过程中DNA甲基化多态性的变化。利用25对AFLP引物共获得120个位点,其中15个位点呈现甲基化多态性,共获得78条多态性条带。根据多态性条带在不同世代样本中出现的多少计算多态性条带比例,其中最高比例出现在G5代(10.26%),最低比例出现在G6代(1.28%)。多态性条带在不同世代间比例的变化趋势表明,褐飞虱对吡虫啉的筛选产生快速应答。在筛选早期(G1,G2和G3)世代间DNA甲基化多态性比例差异相对较小,变化范围在3.85%6.41%之间;在筛选中期(G4,G5和G6)世代间比例差异较大,变化范围在1.28%10.26%之间;在筛选后期(G7,G8和G9)世代间比例差异相对较小,变化范围在5.13%7.69%之间。结果说明,吡虫啉的连续施用能够诱导褐飞虱基因组产生甲基化变异,初步揭示甲基化在褐飞虱抗药性产生过程中参与了基因组的表达调控。