摘要: 【目的】本研究旨在探究意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica去甲基化酶AmALKBH基因对生长发育过程和mRNA甲基化的潜在调控作用，为深入开展AmALKBH的功能研究提供新理论基础和参考。【方法】使用多种软件对5个AmALKBH基因（AmALKBH1,AmALKBH4,AmALKBH6,AmALKBH7及AmALKBH8）进行生物信息学分析，并进行多物种间的同源序列比对和系统进化树构建。利用qRT-PCR检测5个AmALKBH基因（AmALKBH1,AmALKBH4,AmALKBH6,AmALKBH7及AmALKBH8）在意大利蜜蜂不同发育阶段（卵、幼虫和蛹）,1, 7和18日龄成年工蜂脑中以及1日龄成年工蜂不同组织（触角、脑、咽下腺、蜜囊、中肠、回肠、直肠、脂肪体和毒腺）中的表达量。同时利用高效液相色谱三重四级杆串联质谱（high performance liquid chromatography tandem triple quadrupole mass spectrometry, HPLC-QqQ-MS/MS）检测意大利蜜蜂以上不同发育阶段以及1, 7和18日龄成年工蜂脑样品中mRNA m⁶A甲基化的水平。【结果】意大利蜜蜂的5个AmALKBH基因（AmALKBH1,AmALKBH4,AmALKBH6,AmALKBH7和AmALKBH8）分别编码311, 297, 229, 228和585个氨基酸，具有共同的保守基序和结构域，均为亲水性的球形蛋白，5个AmALKBH蛋白之间的理化性质存在差异。意大利蜜蜂的5个AmALKBHs与黑腹果蝇Drosophila melanogaster、智人Homo sapiens、家鼠Mus musculus、拟南芥Arabidopsis thaliana以及大肠杆菌Escherichia coli的ALKBH氨基酸序列一致性为12.92%～46.46%,与东方蜜蜂A.cerana、黄脚胡蜂Vespa velutina和欧洲熊蜂Bombus terrestris的ALKBH亲缘关系最紧密。随着卵期的胚胎发育进程，AmALKBH4和AmALKBH7的表达量逐渐降低，而AmALKBH6的表达量逐渐增高，AmALKBH8的表达量在卵中期（产卵后36 h）最高而后下降，AmALKBH1不表达；在幼虫期和蛹期，5个AmALKBH基因的表达量随发育进程逐渐提高，在褐眼白蛹和褐眼浅色蛹时达到峰值，在羽化出房前有所下降；5个AmALKBH基因均显示出在意大利蜜蜂1日龄成年工蜂触角和脑中高表达；1日龄成年工蜂脑中AmALKBH6,AmALKBH7和AmALKBH8的表达量均显著低于7和18日龄成年工蜂中的。mRNA m⁶A甲基化水平从卵前期到卵中期明显降低，在卵后期（产卵后60 h）显著提高；幼虫和蛹期mRNA m⁶A甲基化水平呈现与基因表达量相似的变化趋势，不同的是在粉眼白蛹时就较早地出现峰值，而mRNA m⁶A甲基化水平在1日龄成年工蜂脑中最高，在7和18日龄成虫年工蜂脑中降低。【结论】研究结果显示出ALKBH基因家族在各物种间的高度保守性，意大利蜜蜂的5个AmALKBH基因之间在序列特征、蛋白结构和表达模式上均存在差异，预示其各自具有功能特点。AmALKBH基因表达量和mRNA m⁶A甲基化水平均随发育阶段出现动态变化，且二者之间存在一定关联，表明AmALKBH基因对意大利蜜蜂生长发育具有潜在调控作用。以上研究结果为揭示AmALKBH基因调控生长发育的分子机制打下良好基础，为进一步提升蜜蜂在基础研究和授粉应用中的价值提供全新理论依据。

摘要: 【目的】建立意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂喙转录组数据库，通过功能注释鉴定味觉受体(gustatory receptor, GR)基因信息，探究GR基因与意大利蜜蜂采集偏好性的相关性。【方法】采用Illumina HiSeq高通量测序平台对采集梨花粉、采集油菜花粉和不采集花粉的意大利蜜蜂工蜂喙进行转录组测序，筛选差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)并进行GO功能注释和KEGG代谢通路分类以及筛选GR基因并构建系统进化树；用qRT-PCR验证9个DEGs的表达。【结果】共筛选得到342个DEGs,其中上调表达基因157个，下调表达基因185个。GO功能注释结果显示，DEGs在GO注释中主要参与细胞过程、细胞解剖实体和结合。KEGG代谢通路分析结果显示，DEGs在氧化磷酸化通路中富集最多，酪氨酸代谢通路次之。在意大利蜜蜂喙转录组共鉴定出9种GR基因，其中4种为已知的GR基因，其余5种为本研究鉴定的未知GR基因，均具有完整的阅读开放框，且都有昆虫GR基因家族所具有的7个跨膜结构域。基于氨基酸序列构建的意大利蜜蜂AmelGRs与黑腹果蝇Drosophila melanogaster GRs的系统进化树，推测AmelGR4和AmelGR6可能属于苦味家族受体，AmelGR9可能属于甜味家族受体。qRT-PCR验证结果表明，筛选的9个DEGs在采集梨花粉的工蜂喙中有8个基因的表达趋势与RNA-seq结果相一致，在采集油菜花粉的工蜂喙中9个DEGs的表达趋势都与RNA-seq结果相一致。【结论】本研究获得了意大利蜜蜂工蜂喙转录组数据，筛选得到了GR基因，通过系统进化分析推测AmelGR4和AmelGR6可能属于苦味家族受体，AmelGR9可能属于甜味家族受体，推测意大利蜜蜂采集偏好性可能与GR基因相关。研究结果有助于在分子水平上加深对昆虫味觉感知系统的理解，为意大利蜜蜂在授粉过程中的采集偏好行为调控机制的研究奠定基础。

摘要: 【目的】通过测定lncRNA13922在西方蜜蜂Apis mellifera工蜂不同发育阶段和成虫组织的表达谱，并解析lncRNA13922的调控方式和作用，为进一步探究lncRNA13922的调控功能和机制提供科学依据。【方法】通过RT-PCR验证lncRNA13922在西方蜜蜂工蜂成虫不同组织(触角、毒腺、脑、中肠、脂肪体、表皮和咽下腺)中的表达量；采用RT-qPCR检测lncRNA13922在西方蜜蜂工蜂不同发育阶段(卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫)和工蜂成虫组织(触角、毒腺、脑、中肠、脂肪体、表皮和咽下腺)中的相对表达量；通过Pearson相关性分析预测与西方蜜蜂lncRNA13922共表达的mRNA;利用miRDeep2将lncRNA13922的核苷酸序列比对到miRBase数据库，再通过miRPara来预测miRNA前体；联用Miranda, RNAhybrid和TargetScan软件分别预测lncRNA13922靶向的miRNA及miRNA靶向的mRNA,取交集作为可靠的靶标集合；根据靶向关系构建竞争性内源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)调控网络，进而利用相关软件对靶mRNA进行GO和KEGG数据库注释。【结果】lncRNA13922在西方蜜蜂工蜂成虫的触角、脑、中肠、脂肪体、咽下腺、表皮和毒腺均能被扩增出符合预期大小(约127 bp)的目的片段。lncRNA13922在西方蜜蜂卵、 3日龄幼虫、 1和2日龄预蛹及4日龄蛹中差异表达，在卵中的表达量最高，且显著高于3日龄幼虫及1和2日龄预蛹中的表达量；lncRNA13922在1, 2, 6, 12, 15和17日龄成虫体内均有表达，但表达量存在差异；lncRNA13922在2日龄成虫体内的表达量最高且显著高于1和17日龄成虫体内的表达量。lncRNA13922在西方蜜蜂工蜂成虫上述7种组织中差异表达，在毒腺中的表达量最高，且显著高于脑、中肠、脂肪体和咽下腺中的表达量。lncRNA13922与29条mRNA潜在共表达且它们的表达量具有正相关关系，与12条mRNA潜在共表达且它们的表达量具有负相关关系。lncRNA13922可作为2个miRNA的潜在前体。lncRNA13922可靶向75个miRNA进而靶向1 833条mRNA。上述靶mRNA涉及细胞部分和细胞等603个GO条目与内吞作用和嘌呤代谢等56条KEGG通路。【结论】西方蜜蜂lncRNA13922在工蜂的不同发育阶段和成虫不同组织中动态差异表达，并通过反式作用、miRNA前体和ceRNA作用网络潜在参与调控发育过程。

摘要: 【目的】本研究旨在系统鉴定和分析西方蜜蜂Apis mellifera肽聚糖识别蛋白（peptidoglycan recognition protein, PGRP）相关基因及其剪接异构体，探析PGRP基因剪接异构体编码蛋白的理化性质和分子特征，并测定PGRP基因剪接异构体在西方蜜蜂工蜂成虫应答东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染中的表达模式，以期为西方蜜蜂PGRP基因剪接异构体的功能研究提供参考和依据。【方法】基于已获得的西方蜜蜂8和11日龄工蜂成虫中肠纳米孔测序数据，利用Blast工具将前期鉴定到的所有全长转录本分别比对到Nr和KEGG数据库，筛选出西方蜜蜂PGRP基因及其剪接异构体，并随机选择PGRP基因的5条剪接异构体通过RT-PCR验证序列的真实性。使用Gffcompare软件将鉴定到的PGRP基因序列比对至西方蜜蜂参考基因组以优化基因结构。采用Astalavista软件鉴定PGRP基因的可变剪接（alternative splicing, AS）事件类型，再通过RT-PCR和Sanger测序验证AS事件。利用相关软件预测和分析PGRP基因剪接异构体编码蛋白的理化性质和分子特征。采用RT-qPCR检测东方蜜蜂微孢子虫接种后西方蜜蜂工蜂成虫中肠中PGRP基因剪接异构体的相对表达量。【结果】共鉴定到西方蜜蜂的4个PGRP相关基因（PGRP-3,PGRP-S2,PGRP-LC和PGRP-LB）及其19条剪接异构体。通过RT-PCR与Sanger测序证实了PGRP基因5条剪接异构体（rna14029, ONT.6350.8, ONT.6350.10, rna24089和ONT.6350.7）的表达和序列真实性。PGRP-3（gene10434）的5′和3′端分别延长了8和1 055 bp,PGRP-S2（gene10435）的5′和3′端分别延长了27和234 bp。通过RT-PCR证实了PGRP-S2的AS事件的真实性。剪接异构体ONT.6350.2编码蛋白的分子式为C₉₆₆H₁₅₀₂N₂₇₂O₂₇₅S₇,分子量约为21 527.63 D,理论等电点为8.94,平均亲水性为-0.119,含有信号肽和PGRP结构域，不含跨膜结构域；剪接异构体ONT.6350.6编码蛋白分子式为C₈₄₁H₁₃₀₁N₂₄₃O₂₄₄S₅,分子量约为18 860.46 D,理论等电点9.14,平均亲水性为-0.324,不含跨膜结构域和信号肽。西方蜜蜂与东方蜜蜂A.cerana的PGRP-S2在进化树上聚为一支。相较于未接种东方蜜蜂微孢子虫的对照组，接种东方蜜蜂微孢子虫的西方蜜蜂工蜂成虫中肠中剪接异构体ONT.6350.2的表达量在接种后2和4 d时显著上调，在接种后3 d时极显著上调；剪接异构体ONT.6350.6与ONT.6350.2的表达模式相同；剪接异构体ONT.6350.2和ONT.6350.6在接种东方蜜蜂微孢子虫后1-4 d时总体上均表现为上升表达趋势。【结论】本研究优化了西方蜜蜂参考基因组上已注释的PGRP-3和PGRP-S2基因结构；揭示剪接异构体ONT.6350.2的编码蛋白可能是分泌蛋白，而剪接异构体ONT.6350.6的编码蛋白可能是胞内蛋白；西方蜜蜂与东方蜜蜂的PGRP-S2同源性最高；剪接异构体ONT.6350.2和ONT.6350.6在西方蜜蜂工蜂成虫应答东方蜜蜂微孢子虫侵染中被激活表达。

摘要: 【目的】本研究旨在通过解析意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica lncRNA15837的调控方式和作用，并检测lncRNA15837在工蜂不同发育阶段和成虫不同组织及幼虫应答蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis侵染中的表达模式，为深入探究lncRNA15837的调控功能与机制提供参考和依据。【方法】基于已获得的意大利蜜蜂7和10日龄工蜂成虫中肠高质量转录组数据，利用Miranda, RNAhybrid和TargetScan软件预测lncRNA15837靶向的miRNA及miRNA靶向的mRNA,再通过Cytoscape v3.7.1软件构建并可视化竞争性内源RNA (competing endogenous RNA, ceRNA)调控网络。使用Blast工具将靶mRNA比对至GO和KEGG数据库以获得相应的功能和通路注释。通过RT-PCR验证lncRNA15837在刚出房工蜂成虫不同组织(触角、咽下腺、脑、表皮、中肠、脂肪体和毒腺)中的表达。利用RT-qPCR检测lncRNA15837在工蜂的不同发育阶段(卵、3日龄幼虫、 1和2日龄预蛹、 4日龄蛹及1, 2, 6, 12, 15和18日龄工蜂成虫)、刚出房工蜂成虫不同组织(触角、咽下腺、脑、表皮、中肠、脂肪体和毒腺)和3日龄幼虫感染蜜蜂球囊菌后4, 5和6日龄幼虫肠道中的表达量。【结果】LncRNA15837可靶向ame-miR-21-x和ame-miR-0046-3p等29个miRNA,进而靶向1 559条mRNA,形成1个复杂的ceRNA网络；上述靶mRNA可注释到436个GO条目，其中114条靶mRNA涉及139个分子功能相关条目，115条靶mRNA涉及257个生物学进程相关条目，67条靶mRNA涉及40个细胞组分相关条目；可注释到224条KEGG通路，其中28条靶mRNA注释到内吞、吞噬细胞和溶酶体等细胞免疫通路，以及157条靶mRNA注释到JAK-STAT, Toll和Imd, NF-kappa B和Toll样受体信号通路等体液免疫通路；lncRNA15837在工蜂卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫中差异表达，在1日龄预蛹中的表达量最低，而在3日龄幼虫中的表达量最高；lncRNA15837在刚出房工蜂成虫的触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮中均有表达但表达量存在差异，在脂肪体中的表达量最低，而在毒腺中的表达量最高；相较于未接种对照组，lncRNA15837的表达量在蜜蜂球囊菌接种组4日龄幼虫肠道中表达量上调，在5和6日龄幼虫肠道中显著上调。【结论】意大利蜜蜂lncRNA15837通过ceRNA网络潜在调控胞吞作用、吞噬细胞和溶酶体等细胞免疫通路和JAK-STAT、Toll和Imd、NF-kappa B和Toll样受体信号通路等体液免疫通路；lncRNA15837在工蜂的3日龄幼虫和工蜂成虫毒腺中特异性高表达；工蜂幼虫肠道中lncRNA15837的表达被蜜蜂球囊菌侵染所激活，提示lncRNA15837是意大利蜜蜂幼虫应答蜜蜂球囊菌侵染的潜在调控因子。