摘要: 【目的】本研究旨在鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana肠粘蛋白AcMucin5AC-1的结构、分布及对中肠的影响，为解析蜜蜂中肠的生理功能提供理论依据。【方法】利用生物信息学比较分析中华蜜蜂AcMucin5AC蛋白的序列特征；利用RT-qPCR检测AcMucin5AC-1在中华蜜蜂4日龄幼虫中肠和表皮以及2日龄幼虫感染中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus, CSBV)后0, 12, 24, 48和72 h时中肠中的表达量。通过原核表达系统对中华蜜蜂AcMucin5AC-1进行表达，亲和层析柱纯化重组蛋白并制备相应多克隆抗体；Western blot检测AcMucin5AC-1在中华蜜蜂健康3-6日龄幼虫中以及4日龄幼虫中肠、表皮和围食膜中的表达，应用间接免疫荧光试验分析AcMucin5AC-1在中华蜜蜂4日龄幼虫中的定位。通过饲喂法利用RNAi沉默中华蜜蜂2日龄幼虫AcMucin5AC-1后12, 24, 48和72 h时分析RNAi干扰效率，利用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色法探究RNAi干扰2日幼虫AcMucin5AC-1后24, 48和72 h时对中华蜜蜂幼虫整体组织形态的影响。【结果】中华蜜蜂基因组中有8个AcMucin5AC基因，其氨基酸序列均含有粘蛋白结构域。RT-qPCR检测结果表明，AcMucin5AC-1在中华蜜蜂4日龄幼虫中肠中表达量较表皮中的高，且在感染CSBV病毒的12和72 h时的2日龄幼虫中肠中比对照组显著下调。成功获得约50 kD的重组蛋白AcMucin5AC-1和多克隆抗体，Western blot结果显示在中华蜜蜂3-6日龄幼虫以及4日龄幼虫中肠、表皮和围食膜的总蛋白中均能检测到AcMucin5AC-1。间接免疫荧光试验结果表明AcMucin5AC-1主要定位在4日龄幼虫中肠和围食膜。RNAi效率检测结果表明，2.0μg/头dsAcMucin5AC-1干扰24 h时中华蜜蜂AcMucin5AC-1较dsEGFP对照组表达量下调92%。HE染色检测结果表明，在AcMucin5AC-1的RNAi后72 h时中华蜜蜂幼虫整个肠腔的细胞间的致密程度减弱，形态结构紊乱。【结论】中华蜜蜂AcMucin5AC-1是位于幼虫的中肠和围食膜的粘蛋白，AcMucin5AC-1的下调影响中华蜜蜂幼虫中肠的形态，暗示该基因在幼虫中肠发育过程中可能发挥重要作用。

摘要: 【目的】本研究旨在克隆西方蜜蜂Apis mellifera RNA m6A甲基转移酶14 (methyltransferase 14, METTL14)基因AmMETTL14,分析AmMETTL14的理化性质和分子特性以及AmMETTL14在工蜂不同发育阶段和不同组织中的表达模式，并制备AmMETTL14多克隆抗体，为持续深入开展AmMETTL14的功能研究提供参考和基础。【方法】通过PCR扩增西方蜜蜂AmMETTL14的CDS并进行Sanger测序验证。使用相关生物信息学软件对AmMETTL14进行生物信息学分析，并构建系统进化树。通过原核表达系统诱导表达AmMETTL14融合蛋白，免疫新西兰白兔以制备多克隆抗体，利用ELISA和Western blot分别检测抗体的效价及特异性。采用RT-qPCR检测AmMETTL14在卵、幼虫、预蛹、蛹及工蜂成虫中以及刚出房工蜂成虫的触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮7种组织中的相对表达量。【结果】成功克隆到西方蜜蜂AmMETTL14的CDS;AmMETTL14的分子式为C_(1957)H_(3113)N_(567)O_(589)S_(15),分子量约为44.49 kD,脂溶系数为79.97,理论等电点为8.58,平均亲水系数为-0.59,不含典型的跨膜结构域和信号肽，可同时定位于细胞核、线粒体和细胞质；西方蜜蜂、中华蜜蜂A.cerana cerana、黑大蜜蜂A.laboriosa、东方蜜蜂A.cerana、大蜜蜂A.dorsata、小蜜蜂A.florea、欧洲熊蜂Bombus terrestris、金环胡蜂Vespa mandarinia、美洲东部熊蜂B.impatiens和黑腹果蝇Drosophila melanogaster的METTL14均含有MT-A70结构域和3个相同的保守基序；AmMETTL14与黑大蜜蜂的METTL14的氨基酸序列一致性最高(65.60%)且亲缘关系最近。制备的AmMETTL14多克隆抗体效价较高(大于512 K)且特异性较强。AmMETTL14在7和8日龄预蛹与卵中的表达量相近且均显著高于在3日龄幼虫中的表达量，在12日龄蛹中的表达量显著高于卵、幼虫和预蛹中的表达量，在6, 12和15日龄工蜂成虫体内的表达量显著高于1日龄工蜂成虫体内的表达量；AmMETTL14在刚出房工蜂成虫脑和咽下腺中的表达量与触角中的表达量相近且均显著高于在毒腺、中肠、脂肪体和表皮中的表达量。【结论】研究结果表明，AmMETTL14可能为亲水性、非跨膜和胞内蛋白，AmMETTL14在幼虫生长发育中发挥潜在的调控作用，制备得到的AmMETTL14的多克隆抗体效价高、灵敏度高和特异性强，为进一步探究AmMETTL14的功能及其参与的表观调控机制打下了基础。

摘要: 【目的】本研究旨在筛选西方蜜蜂Apis mellifera采集蜂咽下腺中高表达的基因，为进一步筛选和研究蜜蜂采集行为相关基因提供依据。【方法】基于前期已获得西方蜜蜂3日龄工蜂(3 d＿W)、10日龄哺育蜂(10 d＿N)、10日龄采集蜂(10 d＿F)、21日龄哺育蜂(21 d＿N)和21日龄采集蜂(21 d＿F)的咽下腺转录组数据，筛选咽下腺差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),并对10日龄和21日龄采集蜂咽下腺中高表达的DEGs进行GO和KEGG富集分析；利用qPCR检测西方蜜蜂采集蜂咽下腺中高表达的4个DEGs (LOC409889,LOC406114,LOC408453和LOC100578735)在不同发育时期(卵、幼虫、蛹、刚出房工蜂、10日龄哺育蜂和21日龄采集蜂)和21日龄采集蜂组织(腹、胸、触角、上颚腺、咽下腺、蛰针、足、肠道、翅和脑)中的表达量。【结果】比较转录组结果表明，164个上调表达的DEGs在21日龄采集蜂咽下腺中的表达量明显高于在3日龄工蜂、10日龄哺育蜂和21日龄哺育蜂咽下腺中的表达量，且在10日龄采集蜂咽下腺中的表达量也高于在10日龄哺育蜂咽下腺中的表达量；105个下调表达的DEGs的表达趋势与上述164个DEGs的相反。GO分析结果表明，10日龄和21日龄采集蜂咽下腺中高表达的164个DEGs显著富集于硫酸盐跨膜转运蛋白活性、硫化合物跨膜转运蛋白活性、铁离子结合和氧化还原酶活性；下调表达的105个DEGs显著富集于核糖体、细胞内核糖核蛋白复合物和核糖核蛋白复合物；KEGG通路分析结果表明，105个下调表达的DEGs显著富集于核糖体以及淀粉和蔗糖代谢两个通路。qPCR检测结果显示，LOC409889,LOC406114,LOC408453和LOC100578735均在21日龄采集蜂中表达量最高；LOC406114和LOC100578735在21日龄采集蜂咽下腺中的表达量最高，而在其他组织中表达量较低或不表达。【结论】本研究通过比较转录组筛选鉴定了西方蜜蜂采集蜂咽下腺中高表达的DEGs,为深入研究采集蜂咽下腺的功能提供了数据，同时也为研究西方蜜蜂的采集行为及采集力强蜂种的分子选育提供新的视角。

摘要: 【目的】东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae作为蜜蜂微孢子虫病的主要病原体，对其侵染机制的相关研究鲜有报道。本研究旨在对团队前期通过质谱鉴定获得的东方蜜蜂微孢子虫候选孢壁蛋白NcER＿100148进行原核表达，明确其亚细胞定位，并初步探索其生物学功能。【方法】通过在线软件对前期鉴定的东方蜜蜂微孢子虫候选孢壁蛋白NcER＿100148序列进行生物信息学分析；利用RT-PCR检测东方蜜蜂微孢子虫侵染后西方蜜蜂Apis mellifera成蜂中肠中NcER＿100148的表达量；将NcER＿100148基因片段克隆至原核表达载体pET30a中，IPTG诱导表达重组蛋白并用于制备多克隆抗体；利用Western blot检测NcER＿100148在东方蜜蜂微孢子虫成熟孢子中的表达量；通过间接免疫荧光和免疫电镜技术分析NcER＿100148在东方蜜蜂微孢子虫成熟孢子中的亚细胞定位；利用Western blot和免疫共沉淀法分别分析重组蛋白NcER＿100148与东方蜜蜂微孢子虫几丁质孢子壳(chitin spore coats, CSCs)和极管蛋白NcPTP2和NcPTP3的相互作用关系。【结果】序列分析结果表明，东方蜜蜂微孢子虫NcER＿100148预测分子量为12.169 kD,含1个O-糖基化位点、1个N-糖基化位点和1个糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol, GPI)锚定位点；RT-PCR检测结果表明，NcER＿100148在东方蜜蜂微孢子虫感染后4 d时的西方蜜蜂成蜂中肠中开始表达；Western blot结果表明，NcER＿100148蛋白能在成熟孢子表面表达，并且能够与东方蜜蜂微孢子虫的CSCs互作；亚细胞定位结果显示NcER＿100148定位于东方蜜蜂微孢子虫的成熟孢子孢壁上；Western blot和免疫共沉淀结果显示重组蛋白NcER＿100148能够与极管蛋白NcPTP2和NcPTP3相互作用。【结论】NcER＿100148是定位在东方蜜蜂微孢子虫的成熟孢子孢壁上的一个新型孢壁蛋白，且其可能在孢子内壁的构建、极管的盘绕与固定和参与对宿主的侵染等过程中扮演重要的角色。

摘要: 【目的】本研究旨在明确西方蜜蜂Apis mellifera几丁质合成酶(chitin synthase, CHS)基因的分子特性，并揭示CHS在西方蜜蜂工蜂幼虫响应蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis胁迫的免疫应答中的功能。【方法】利用相关生物信息学软件预测和分析西方蜜蜂CHS蛋白的分子特性、保守基序和结构域。使用MEGA X软件对西方蜜蜂和其他昆虫CHSs的氨基酸序列进行系统进化分析。采用体外转录法合成CHS和egfp的dsRNA,饲喂蜜蜂球囊菌胁迫的西方蜜蜂工蜂3日龄幼虫以进行RNAi,并利用RT-qPCR检测西方蜜蜂工蜂5日龄幼虫肠道中CHS及宿主响应蜜蜂球囊菌侵染的免疫相关基因abaecin,apidaecin,birc5,defensin-1和PGRP-S2的表达量。【结果】西方蜜蜂CHS蛋白含有1 572个氨基酸，属于20种氨基酸，其中正电荷氨基酸与负电荷氨基酸分别为177和169个，分子量约为178.77 kD,等电点为6.65;含纤维素合酶CESA3催化结构域。在西方蜜蜂和东方蜜蜂A.cerana等共13种昆虫的CHSs中均鉴定到3个Motif (Motif 1, Motif 2和Motif 3)和2个结构域(Chitin＿synth＿2和Glyco＿trans＿2＿3)。系统进化树表明，膜翅目的西方蜜蜂与东方蜜蜂的CHSs的氨基酸序列一致性最高，聚为一支且自举值为100。相较于dsegfp饲喂对照组，dsCHS饲喂组5日龄幼虫肠道中CHS的表达量显著下调，干扰效率为29.40%,abaecin,birc5和defensin-1的表达量均极显著上调，PGRP-S2的表达量显著上调，apidaecin的表达量极显著下调。【结论】西方蜜蜂CHS可能是胞内亲水性跨膜蛋白，西方蜜蜂与其他昆虫CHSs的氨基酸序列具有较高的保守性，其中与东方蜜蜂的CHS的氨基酸序列之间保守性最高，CHS影响西方蜜蜂工蜂幼虫响应蜜蜂球囊菌胁迫的免疫应答。