摘要: [目的]Argonaute (AGO)家族是一类在进化上高度保守的蛋白家族,其在真核生物中主要参与形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),进而通过沉默基因表达参与诸多生物学过程。蜜蜂AGO蛋白的相关研究迄今仍然缺失。本研究拟通过预测西方蜜蜂Apis mellifera的AGO1(AmAGO1)理化性质和分子特性,解析AmAGO1在西方蜜蜂中的时空表达谱,并制备AmAGO1的多克隆抗体,为深入开展AmAGO1的功能与机制研究提供参考和基础。[方法]PCR扩增西方蜜蜂AmAGO1的编码序列(coding sequence,CDS);通过生物信息学预测AmAGO1蛋白的理化性质和分子特性;利用RT-qPCR检测AmAGO1在西方蜜蜂工蜂卵、3日龄幼虫、7日龄预蛹、8日龄预蛹、12日龄蛹以及1,2,6,12,15和18日龄成虫以及工蜂成虫触角、咽下腺、脑、表皮、中肠、脂肪体和毒腺中的表达量;构建原核表达质粒后诱导表达AmAGO1融合蛋白,并鉴定其表达形式;制备AmAGO1多克隆抗体,利用ELISA,Western blot和免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)分别检测抗体效价、灵敏度和特异性。[结果]成功克隆到西方蜜蜂AmAGO1的CDS;AmAGO1含928个氨基酸,分子式为C_(4624) H_(7332) N_(1316) O_(1325) S_(51),分子量约为104.2 kD,等电点为9.31,平均亲水系数为-0.2965,含86个磷酸化位点及典型的PAZ结构域和PIWI结构域,但不存在典型的信号肽;AGO1在智人Homo sapiens、斑马鱼Danio rerio、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、家蚕Bombyx mori、西方蜜蜂、东方蜜蜂A.cerana和欧洲熊蜂Bombus terrestris中具有较高的序列一致性;西方蜜蜂和东方蜜蜂的AGO1聚为一支,同源性最高。AmAGO1在西方蜜蜂工蜂卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫中均有表达但表达量存在差异,3日龄幼虫和7日龄预蛹中AmAGO1的表达量显著低于卵中的表达量,而8日龄预蛹和12日龄蛹中AmAGO1的表达量显著高于卵中的表达量;AmAGO1在1,2,6,12,15和18日龄工蜂体内均有表达但表达量也存在差异,其中1日龄成虫体内AmAGO1的表达量显著高于其他日龄成虫体内的表达量;AmAGO1在工蜂成虫触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮中均有表达但表达量存在差异,触角中AmAGO1的表达量与咽下腺中的相差无几,但二者均显著高于毒腺、脑、中肠、脂肪体和表皮中AmAGO1的表达量;AmAGO1融合蛋白的表达形式为包涵体;制备的AmAGO1多克隆抗体具有较高的效价、灵敏度和特异性。[结论]AmAGO1可能是亲水性胞内蛋白,含有典型的PAZ结构域和PIWI结构域;AmAGO1在西方蜜蜂工蜂不同组织和不同发育阶段发挥潜在的重要功能;成功制备出高效价、高灵敏度和强特异性的AGO1多克隆抗体。

摘要: [目的]基于抗白垩病相关单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点C2587245T在意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica雄蜂幼虫中白垩病抗性检验,验证该位点遗传稳定性和抗病性,为分子标记辅助育种在育种生产中直接应用提供技术支持。[方法]通过白垩病虫尸,在实验室条件下制备白垩真菌孢子悬液,通过形态学和分子生物学方法鉴定蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis。使用无伤害提取意大利蜜蜂蜂蜂王DNA筛选出SNP位点C2587245T为C/C和T/T基因型的蜂王,并培育C/C和T/T基因型处女王,用二氧化碳刺激其产出雄蜂卵,选择2日龄意大利蜜雄蜂幼虫进行实验室培养,3日龄龄雄蜂幼虫接种5×104个孢子/μL的蜜蜂球囊菌悬液10 d,观测接种蜜蜂球囊菌后的C基因型和T基因型雄蜂幼虫的生长情况和存活率。[结果]通过无伤害提取DNA的方法可以在不影响意大利蜜蜂雄蜂幼虫正常生活的条件下提取出高质量的DNA;用本研究的饲养方法可以保证意大利蜜蜂雄蜂幼虫在实验室条件的正常生长发育。C基因型和T基因型意大利蜜蜂雄蜂3日龄幼虫接种蜜蜂球囊菌后在发病时间和发病症状等方面都有极其显著差异,C基因型雄蜂幼虫在表现疾病典型症状的时间上比T基因型雄蜂幼虫晚大约2 d;在接种蜜蜂球囊菌后6 d时两种基因型雄蜂幼虫表现出的症状差异最为明显。[结论]雄蜂由于其纯合单倍体的生物学特性,更方便验证SNP位点C2587245T纯合的抗病作用。SNP位点C2587245T为C基因型雄蜂幼虫具有良好的抗白垩病能力,并且SNP位点C2587245T具有稳定的遗传性,这些研究结果可为在蜜蜂抗病育种领域提供一种可靠的分子辅助标记,为后续雄蜂转录组测序、寻找雄蜂和工蜂在免疫相关基因表达方面的差异,尝试找到SNP位点C2587245T对白垩病所特有的抗病机制提供基础。

摘要: 蜂王与工蜂具有相同遗传背景，都是由受精卵发育而成，但由于发育过程中营养和空间差异导致蜂王与工蜂在形态、生理和行为上出现显著差异，特别是蜂王寿命比工蜂寿命高数十倍，表现出很强的衰老与寿命可塑性。胰岛素信号通路(insulin signal pathway, IIS)可调节工蜂行为，进而影响工蜂寿命；蜂王长寿与氧化应激增加和应激防御增强有关；卵黄原蛋白(vitellogenin, Vg)与保幼激素(juvenile hormone, JH)之间存在相互作用，高卵黄原蛋白和低保幼激素水平与长寿有关；端粒酶活性和端粒长度受蜜蜂发育及级型影响，蜂王端粒长度、端粒酶活性都明显高于工蜂的，越冬工蜂比夏季工蜂寿命更长，端粒酶活性更高；线粒体损伤是衰老的标志，而老年蜂王线粒体功能维持在旺盛状态；衰老与DNA甲基化密切相关，DNA甲基化和组蛋白修饰在社会性昆虫可塑性调控中发挥重要作用。随着人口老龄化加剧和衰老相关疾病高发，“健康老龄化”引发了社会各界对生命科学和社会科学中一系列重要问题的密切关注。有关蜜蜂衰老与寿命调控的研究结果将对衰老生物学有重要参考价值。

摘要: 【目的】利用代谢组学分析患枣花病意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂中肠内代谢物变化，挖掘出与蜜蜂枣花病相关的重要代谢通路，旨在揭示蜜蜂枣花病发病机制，为枣花病靶向药物的研发提供理论依据。【方法】分别利用液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)和气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)技术对患枣花病和健康意大利蜜蜂工蜂进行中肠非靶向代谢组检测；通过主成分分析(principal component analysis, PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA),以变量投影重要性(variable projection importance, VIP)>1.0,差异倍数(fold change, FC)>2.0和P<0.05为标准筛选差异代谢物，并对其进行KEGG注释和通路富集；利用生化方法测定意大利蜜蜂工蜂中肠中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)的活性，并通过qRT-PCR测定抗氧化基因Sod1,Sod2和CAT及免疫基因Defensin,Hymenoptaecin,Apidaecin和Abaecin在中肠内的表达量。【结果】基于LC-MS代谢组检测，正离子和负离子模式下分别获得患枣花病和健康意大利蜜蜂工蜂间差异代谢物49和43种，其中分别有33和30种能够在HMDB和KEGG数据库中鉴定到。基于GC-MS代谢组检测，患枣花病和健康意大利蜜蜂工蜂间筛选到22种挥发性差异代谢物，其中11种能够在HMDB和KEGG数据库中鉴定到。与健康意大利蜜蜂工蜂相比，患枣花病意大利蜜蜂工蜂中肠内经鉴定的73种差异代谢物中，28种含量上升，45种含量下降；其中，京尼平苷酸、吲哚-3-乙酸、喹啉和棉子糖在患枣花病意大利蜜蜂工蜂中肠内大量积累，而乌索酸、L-苏糖酸、葡萄糖酸、D-半乳糖酸、苏糖酸和芦丁的含量下降最为明显。KEGG代谢通路富集分析结果表明，患枣花病和健康意大利蜜蜂工蜂间差异代谢物显著富集在抗坏血酸和醛酸代谢、半乳糖代谢及丁酸甲酯代谢这3条碳水化合物代谢通路。酶活性测定及qRT-PCR结果显示，与健康意大利蜜蜂工蜂相比，患枣花病意大利蜜蜂工蜂中肠中SOD和CAT酶活显著降低，Sod1,Sod2,CAT,Defensin,Hymenoptaecin和Apidaecin的表达量均呈下调趋势。【结论】利用LC-MS和GC-MS非靶向代谢组学均能够有效地分析枣花病影响下蜜蜂中肠内代谢物的变化差异。研究结果表明，意大利蜜蜂采集枣花后其中肠内碳水化合物代谢发生异常，引起肠道抗氧化和免疫能力显著下降，推测肠道功能障碍是导致蜜蜂死亡的主要原因。该研究为蜜蜂枣花病的发病机理提供了新见解。

摘要: 中华蜜蜂Apis cerana cerana是我国十分关键和重要的传粉媒介昆虫，在不同栖息地中广泛分布，表现出飞行敏捷、采蜜期长和适应性强等优点。但近些年中华蜜蜂正面临前所未有的种群多样性下降，为保护这些特定的中华蜜蜂种群的遗传资源，研究人员基于几何形态学、分子生物学和基因组学等技术手段对中华蜜蜂遗传分化和环境适应机制进行了研究，而在我国这些多样化的中华蜜蜂种群为揭示其种群适应性进化规律提供了绝佳材料。本文从中华蜜蜂种群遗传分化与环境变化的相关性、形态变异与环境适应、环境适应性生理和行为改变及这些表型变化的遗传机制4个方面综述了相关研究进展。研究发现，物理屏障和生态环境的变化，特别是海拔和纬度相关环境变化是造成中华蜜蜂种群分化的主要原因。气候因子中，温度、氧气、辐射和湿度等对中华蜜蜂环境适应性的形态发育和生理生态特征产生重要影响。形态特征的变化主要体现在体型大小和体色上，代谢生理和行为改变是其环境适应的重要策略。基于现代基因组学和分子生物学技术的种群遗传学和种群基因组学研究发现，与社会分工行为、学习感知行为、信息感知、生长发育、温度适应和代谢等相关的基因或通路受到自然选择作用，这为中华蜜蜂适应不同栖息地以及蜂种演化提供了分子证据，但应对不同环境因子的分子进化机制有待进一步研究和明确。本文对中华蜜蜂遗传分化和环境适应机制的研究综述，加深了我们对古老蜂种进化历史和遗传多样性的理解，同时为后续深入研究社会性昆虫对不同环境的适应性机制和制定有效的保护策略奠定基础。