摘要: 【目的】本研究旨在克隆鉴定意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica铁蛋白基因Am Fer3HCH,分析其在意大利蜜蜂应对温度胁迫时的组织表达变化,探讨铁蛋白Am Fer3HCH在蜜蜂应对环境温度胁迫中的作用。【方法】PCR扩增意大利蜜蜂铁蛋白基因Am Fer3HCH的cDNA序列,并对其编码氨基酸序列进行生物信息学鉴定;实时定量PCR分析该基因在不同温度(40℃和5℃)胁迫下的意大利蜜蜂工蜂成虫胸、中肠和脂肪体中的表达变化。【结果】PCR扩增获得意大利蜜蜂铁蛋白基因Am Fer3HCH,cDNA片段大小为507 bp,其核苷酸序列与GenBank意大利蜜蜂基因组数据库中的铁蛋白基因Fer3HCH(GenBank登录号:GB55416)的完全一致,确认为Am Fer3HCH基因序列。Am Fer3HCH鉴定为重链型铁蛋白,在系统进化上聚类于重链型铁蛋白分支,其氨基酸序列具有重链型铁蛋白特有的Fe2+氧化酶活性中心,含有铁蛋白家族成员所共有的水合氧化铁成核中心和铁离子通道。实时定量PCR分析显示,与对照组相比在短时高温(40℃,048 h)胁迫过程中,Am Fer3HCH在意大利蜜蜂工蜂成虫胸、中肠和脂肪体中的表达水平整体呈先上升、后下降再上升的趋势;在低温(5℃,06 h)胁迫处理过程中,中肠和脂肪体中Am Fer3HCH基因的表达量呈先上升后下降趋势,而在胸中表达量逐渐下降。【结论】意大利蜜蜂铁蛋白Am Fer3HCH为重链型铁蛋白,在意大利蜜蜂对极端温度胁迫的应答中扮演了重要的角色。

摘要: 【目的】本研究旨在明确中华蜜蜂Apis cerana cerana半乳糖凝集素(galectin)的功能及其与病毒的相互作用。【方法】提取中华蜜蜂的总RNA,利用RT-PCR技术获得Galectin基因,然后利用生物信息学软件对基因序列及其推导氨基酸序列和结构特征进行分析;再依据大肠杆菌Escherichia coli密码子的偏嗜性对该基因密码子进行优化、原核表达,并制备重组蛋白;最后,通过Far-western blotting技术检测纯化的重组蛋白与纯化的中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)、慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)和残翅病毒(Deformed wing virus,DWV)的结合情况。【结果】从中华蜜蜂中克隆到Galectin基因,并将其命名为Ac Galectin(Gen Bank登录号:MG557559),其cDNA全长为1 473 bp。Ac Galectin空间结构比较稳定,包含一个半乳糖识别结构域。系统进化树表明,Galectin明显分为两簇,膜翅目蜜蜂科昆虫的Galectin形成一个簇,而其他昆虫Galectin形成另一簇。经密码子优化后的Ac Galectin基因能够在大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中高效表达。纯化的重组Ac Galectin蛋白可与CSBV和CBPV结合,但不与DWV结合。【结论】结果表明Ac Galectin与蜂病毒CSBV和CBPV有结合作用。本研究为Ac Galectin在CSBV和CBPV感染过程中的功能研究奠定了基础。

摘要: 【目的】克隆获得中华蜜蜂Apis cerana cerana转录因子AP-1(transcription factor AP-1)基因Acc AP-1序列,分析其在中华蜜蜂不同发育时期和组织中以及不同非生物应激条件下的表达差异,为该基因的功能研究提供参考。【方法】以中华蜜蜂全组织cDNA为模板,利用RT-PCR技术扩增克隆获得中华蜜蜂转录因子AP-1基因cDNA序列;利用生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;采用MEGA 5.2软件中的邻接法(neighbor-joining,NJ)构建中华蜜蜂转录因子AP-1与其他膜翅目昆虫同源AP-1蛋白系统发育树;通过实时定量PCR分析中华蜜蜂转录因子AP-1基因在不同发育时期(1-6日龄幼虫、预蛹、白眼蛹、红眼蛹、褐眼蛹、1日龄成年工蜂和15日龄成年工蜂)以及15日龄成年工蜂不同组织(头、肌肉、表皮、中肠、直肠和毒腺)中的mRNA表达情况;将15日龄成年工蜂分别置于极端温度(4℃,16℃和44℃)下,以及饲喂含有农药(0.01 mL/L百草枯)和重金属(1 mg/mL Cd Cl2)的蔗糖溶液条件下,分析目的基因mRNA的表达情况。【结果】克隆获得了中华蜜蜂转录因子AP-1基因Acc AP-1(GenBank登录号:MF994311)开放阅读框(ORF)的序列,其长度为813 bp,编码270个氨基酸,预测蛋白分子量为30.24 kD,理论等电点为8.31。保守结构域分析表明,在第7-137位氨基酸之间存在一个Jun超家族的保守结构域,在第195-255位氨基酸之间存在一个b ZIP_Jun超家族的保守结构域。氨基酸序列比对以及进化树结果显示,中华蜜蜂与西方蜜蜂Apis mellifera的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,Acc AP-1在各发育时期表达量差异显著(P<0.05),其中,在1日龄幼虫和15日龄成蜂期表达量最高;Acc AP-1在测试的各组织中均有表达,在肌肉中的表达量最高(P<0.05)。不同非生物应激条件下的表达量分析表明,4℃低温可以诱导Acc AP-1表达量显著升高(P<0.05),16℃处理0.52 h可显著提高其表达量(P<0.05),2 h后表达量逐渐降低,而44℃处理时除了在15 min时表达量显著下降(P<0.05),其余时间点表达量差异不显著(P>0.05);在饲喂含有百草枯的蔗糖溶液后,其表达量显著降低(P<0.05),而Cd Cl2处理诱导其表达量显著升高(P<0.05)。【结论】结果提示Acc AP-1基因可能参与中华蜜蜂机体抵抗外界环境压力的过程。

摘要: 用能溶解肌球蛋白但不溶解副肌球蛋白的溶液(300 mM KCI,pH6.0)处理分离的蜜蜂间接飞翔肌粗肌丝,经数分钟后可以看到粗肌丝端头散开成为多根微丝,微丝数最多为7根。延长处理时间,可以见到粗肌丝中央部分只剩下直径约为5 nm的徽丝。实验结果支持我们以前提出的蜜蜂间接飞翔肌粗肌丝的结构模式,并指示贯穿肌小节、两端都和Z线相连的内芯至少部分由副肌球蛋白组成。只存在于A带的,由6根微丝形成的外套是由肌球蛋白分子组成。

摘要: [目的]分析红背中华蜜蜂Apis cerana cerana色素通路相关基因的表达差异,揭示红背中华蜜蜂色素形成的分子机制。[方法]采用体视显微镜观察刚出房红背中华蜜蜂和黑背中华蜜蜂(正常个体)成年工蜂的体色差异。通过同源比对鉴定中华蜜蜂成年工蜂黑色素代谢通路8个基因(PAH,TH,DDC,ebony,tan,aaNAT,yellow-y和laccase 2)、蝶呤通路4个基因(GTPCH I,SPR,PTPS和GC-1)、眼色素通路2个基因(vermilion和cinnabar)以及尿酸盐转运相关4个基因(BLOS2,HPS5,OK和Varp)的同源基因;运用荧光定量PC R检测上述色素通路基因在红背中华蜜蜂和黑背中华蜜蜂成年工蜂胸部背板和腹部体壁中的相对表达量。[结果]红背中华蜜蜂和黑背中华蜜蜂成年工蜂体色差异表现在胸部背板:红背中华蜜蜂胸部背板呈现棕红色,黑背中华蜜蜂胸部背板则为黑色。荧光定量PCR检测结果表明,红背中华蜜蜂成年工蜂胸部背板tan,laccase 2,SPR,vermilion,cinnabar,BLOS2和OK表达量与黑背中华蜜蜂成年工蜂的有显著性差异。[结论]红背中华蜜蜂和黑背中华蜜蜂的体色差异位于胸部背板,这种体色分化的现象受到蜜蜂体内黑色素、蝶呤、眼色素通路及尿酸盐转运相关基因共同作用的影响。