摘要: 从中华蜜蜂、意大利蜜蜂和大胡蜂、墨胸胡蜂、额斑黄胡蜂、亚非马蜂 6种蜂的雌成蜂毒腺中快速抽提总RNA ,用RT PCR方法分别扩增各得到大小约为 15 0bp的cDNA片段 ,进一步将这 6个片段克隆入pGEM Teasy载体 ,进行测序和序列分析。结果表明 ,所扩增得到的 6个片段长度均为 14 1bp ,均为编码蜂毒apamin前体的cDNA。序列比较发现 ,中华蜜蜂、大胡蜂、墨胸胡蜂和亚非马蜂序列完全一样 ,都与已发表意大利蜜蜂precursorofapamin核苷酸序列具有 95 %同源性 ,氨基酸序列具有 95 %的同源性。额斑黄胡蜂和意大利蜜蜂precursorofapamin核苷酸序列完全一样。本研究首次从中华蜜蜂与几种胡蜂中克隆到蜂毒precursorofapamin基因 ,并发现胡蜂科与蜜蜂科来源的蜂毒明肽序列是完全保守的。

摘要: 从中华蜜蜂工蜂毒腺中快速抽提总RNA ,用RT PCR方法扩增得到该蜂毒的透明质酸酶 (AcHya)基因 ,其核苷酸序列全长为 1 1 6 4bp ,可编码 3 87个氨基酸残基 ,预计分子量为 42 .6kD。将所推导出的氨基酸序列与其它 6种透明质酸酶 (Hya)氨基酸序列比较 ,结果表明 ,AcHya与意大利蜜蜂Hya非常相似 ,具有91 %的同源性 ,与长黄胡蜂Hya、常见黄胡蜂Hya、、马蜂Hya、吸血沙蠓唾腺Hya、人精液PH2 0Hya的同源性分别为 5 4 %、5 2 %、46 %、2 7%和 2 0 %。同时根据氨基酸序列用GENETYX程序绘制了 7种Hya的分子系统树 ,并根据同源性比较分析了 7种Hya的保守性、结构与功能的关系

摘要: 【目的】建立中华蜜蜂Apis cerana cerana体内电穿孔外源基因表达系统，利用该系统评估不同来源启动子在中华蜜蜂体内的转录驱动效率，并基于此优化构建高效、特异的中华蜜蜂基因工程载体。【方法】同源重组法构建EGFP报告基因的过表达质粒，通过第2腹板气孔对中华蜜蜂红眼蛹显微注射质粒，随后对注射部位进行电击。综合利用显微注射技术、体内电穿孔技术和报告基因定量分析中华蜜蜂内源启动子AcActin5c启动子(pAcActin5c)、意大利蜜蜂A.m.ligustica内源启动子AmlActin5c启动子(pAmlActin5c)和巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子(pCMV)经电转化后在中华蜜蜂体内对EGFP表达的驱动效率。【结果】成功构建了用于显微注射的过表达pAcActin5c-EGFP,pAmlActin5c-EGFP,pCMV-EGFP和EGFP的载体。结合中华蜜蜂显微注射系统和电转化系统建立了一套适用于中华蜜蜂的体内电穿孔外源基因表达系统。注射表达质粒并电击后，3种不同来源启动子(pAcActin5c,pAmlActin5c和pCMV)在中华蜜蜂体内对EGFP表达均具有显著的启动效果，而仅注射表达质粒不进行电击的处理组中3种启动子对EGFP表达均未表现明显的启动效果。此外，不同来源启动子在对EGFP表达的启动时序上存在差异，中华蜜蜂启动子pAcActin5c在电穿孔进入中华蜜蜂体内后能够较为快速地响应并启动外源基因EGFP的表达，而意大利蜜蜂的pAmlActin5c和病毒的pCMV则响应较慢。【结论】本研究首次成功建立了中华蜜蜂体内电穿孔外源基因表达系统，利用该系统可快速筛选适用于中华蜜蜂的高效启动子，为未来在中华蜜蜂中进行更深入的基因功能研究提供了重要工具。

摘要: 【目的】本研究旨在解析西方蜜蜂Apis mellifera的ame-miR-927-b及其靶基因Tetraspanin2A（Tsp2A）在西方蜜蜂工蜂幼虫肠道应答蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis侵染过程中的表达模式，并揭示ame-miR-927-b的调控作用。【方法】西方蜜蜂工蜂3日龄幼虫饲喂含1×10⁶孢子/mL蜜蜂球囊菌的饲料，通过Stem-loop RT-PCR验证西方蜜蜂工蜂6日龄幼虫肠道中ame-miR-927-b的表达；采用RT-qPCR检测ame-miR-927-b在接种和未接种蜜蜂球囊菌的西方蜜蜂工蜂4,5和6日龄幼虫肠道中的表达量。利用生物信息学预测ame-miR-927-b的靶基因并进行数据库注释，解析靶基因Tsp2A编码蛋白的理化性质、分子特征和系统进化。采用RT-qPCR检测Tsp2A在上述西方蜜蜂工蜂4,5和6日龄幼虫肠道中的表达量。西方蜜蜂工蜂3日龄幼虫饲喂Agomir或Antagomir,利用RT-qPCR检测过表达或敲降ame-miR-927-b后工蜂6日龄幼虫肠道中的Tsp2A的表达量。【结果】西方蜜蜂工蜂3日龄幼虫接种蜜蜂球囊菌后，ame-miR-927-b在西方蜜蜂6日龄幼虫肠道中表达。与未接种蜜蜂球囊菌的对照组相比，西方蜜蜂工蜂3日龄幼虫蜜蜂球囊菌接种后，ame-miR-927-b的表达量在4,5和6日龄工蜂幼虫肠道中均显著下调。预测ame-miR-927-b靶向30个基因，可注释到16个功能条目和94条通路，靶基因Tsp2A编码蛋白的分子式为C₁₂₇₁H₁₉₈₃N₃₀₃O₃₃₃S₁₆,相对分子量约为27.35 kD,理论等电点为6.71,含有4个跨膜结构域，但不含典型信号肽，Tsp2A主要定位于细胞质；西方蜜蜂与东方蜜蜂Apis cerana的Tsp2A在系统进化树上聚为一支。西方蜜蜂工蜂3日龄幼虫接种蜜蜂球囊菌后，在4和6日龄工蜂幼虫肠道中Tsp2A的表达量与未接种蜜蜂球囊菌的对照组的相比显著上调，在5日龄幼虫肠道中比对照组的上调。与阴性对照（饲喂Agomir-NC）比，3日龄工蜂幼虫饲喂Agomir后，6日龄工蜂幼虫肠道中ame-miR-927-b的表达量显著上调，Tsp2A的表达量极显著下调；与阴性对照（饲喂Antagomir-NC）比，3日龄工蜂幼虫饲喂Antagomir后，6日龄幼虫肠道中ame-miR-927-b的表达量极显著下调，Tsp2A的表达量极显著上调。【结论】蜜蜂球囊菌侵染影响西方蜜蜂工蜂幼虫肠道中ame-miR-927-b的表达。ame-miR-927-b的靶基因Tsp2A编码蛋白是一种潜在的疏水性、跨膜和胞内蛋白；西方蜜蜂和东方蜜蜂的Tsp2A同源性最高。ame-miR-927-b负调控Tsp2A的表达进而参与对蜜蜂球囊菌的侵染应答。

摘要: 【目的】蜕皮激素受体(ecdysone receptor, EcR)在昆虫的发育和代谢等生理过程中具有重要功能。本研究旨在解析西方蜜蜂Apis mellifera EcR蛋白AmEcR的理化性质、分子特性、保守结构域和系统进化，并探究AmEcR在工蜂幼虫发育阶段的作用，以期丰富对AmEcR在幼期发育中的功能的认识。【方法】利用生物信息学软件分析西方蜜蜂AmEcR蛋白的分子特性和保守基序，并构建西方蜜蜂及其他8个近缘物种EcR蛋白系统进化树；利用RT-qPCR检测AmEcR在西方蜜蜂工蜂4和6日龄幼虫、2日龄预蛹以及1, 3, 5, 7和9日龄蛹中的表达量；利用RNAi抑制西方蜜蜂工蜂3日龄幼虫AmEcR的表达，通过酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测4-6日龄工蜂幼虫的蜕皮激素(ecdysone)滴度和体重，并利用RT-qPCR检测4-6日龄工蜂幼虫肠道中蜕皮激素信号通路下游基因AmEcR,AmUsp和AmHex70b的表达量。【结果】西方蜜蜂AmEcR蛋白(GenBank登录号：NM＿001098215.2)含有629个氨基酸，预测分子量约为66.78 kD,脂溶系数为66.09,等电点为6.31,亲水系数为-0.481;AmEcR含有两个跨膜结构域，但不含信号肽，主要定位于细胞核。AmEcR的三级结构与模板A0A7M7H321.1.A之间的同源性为99.84%。在AmEcR蛋白中鉴定到NR＿DBD＿EcR和NR＿LBD＿EcR保守结构域；西方蜜蜂与黑大蜜蜂A.laboriosa和东方蜜蜂A.cerana的EcR蛋白聚为一大支，亲缘关系较近。AmEcR在工蜂4日龄幼虫和2日龄预蛹期的表达量较高，明显高于在蛹期的表达量。与对照组相比，RNAi抑制AmEcR的表达后，蜕皮激素滴度在工蜂4-6日龄幼虫中均极显著降低，AmUsp和AmHex70b的表达量也降低，工蜂4和6日龄幼虫体重显著降低。【结论】干扰AmEcR的表达导致西方蜜蜂工蜂幼虫蜕皮激素滴度下降，蜕皮激素信号通路受抑制，最终影响工蜂幼虫体重。