摘要: 【目的】本研究旨在调查不同蛋白酶抑制剂对梨茎蜂Janus piri和梨瘿蚊Dasineura pyri幼虫中肠蛋白酶活性的影响。【方法】运用生化技术分别测定梨茎蜂2-5龄幼虫和梨瘿蚊1-4龄幼虫中肠pH值和4种中肠蛋白酶(总蛋白酶、强碱性胰蛋白酶、弱碱性胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)活性，进一步在最适pH和幼虫龄期分别测定10种抑制剂对两种害虫幼虫中肠蛋白酶活性的影响。【结果】梨茎蜂和梨瘿蚊幼虫中肠平均pH值分别为8.2和7.6,两种害虫4种中肠蛋白酶活性均在3龄幼虫期最高。对梨茎蜂幼虫中肠总蛋白酶抑制效果最好的是5 mmol/L EDTA,其次是1 mmol/L TPCK;抑制强碱性胰蛋白酶活性效果最好的是1 mmol/L TPCK,抑制弱碱性胰蛋白酶效果最好的是10 mmol/L PMSF,抑制胰凝乳蛋白酶活性效果最好的是5 mmol/L EGTA。对梨瘿蚊幼虫中肠总蛋白酶活性抑制效果最好的是1 mmol/L TPCK,其次是50μg/mL STI;抑制强碱性胰蛋白酶活性效果最好的是5 mmol/L EDTA,抑制弱碱性胰蛋白酶活性效果最好的是10 mmol/L EDTA,抑制胰凝乳蛋白酶活性效果最好的是50μg/mL STI。【结论】对梨茎蜂和梨瘿蚊幼虫中肠总蛋白酶活性抑制效果较好的是TPCK, STI和EDTA;对幼虫中肠强碱性胰蛋白酶活性抑制效果较好的是EDTA和EGTA;对幼虫中肠弱碱性胰蛋白酶活性抑制效果较好的是PMSF, EDTA和TPCK;对幼虫中肠胰凝乳蛋白酶活性抑制效果较好的是EGTA。研究结果为开发与昆虫中肠蛋白酶和抑制剂有关的新型生物农药提供一定的理论参考价值。

摘要: 【目的】硬皮肿腿蜂属Sclerodermus物种是我国林业蛀干害虫重要的天敌寄生蜂。本研究旨在明确硬皮肿腿蜂属在针尾部(Aculeata)中的分类地位，对4种硬皮肿腿蜂的线粒体基因组进行测序，分析其线粒体基因组结构和系统发育位置。【方法】利用Illumina HiSeq对硬皮肿腿蜂属4个种(松褐天牛肿腿蜂Sclerodermus alternatusi、白蜡吉丁肿腿蜂Sclerodermus pupariae、川硬皮肿腿蜂Sclerodermus sichuanensis和苹小吉丁肿腿蜂Sclerodermus sp.)线粒体基因组进行测序，然后对其进行组装和注释，分析其结构特点和碱基组成；在NCBI下载膜翅目(Hymenoptera)其他46个种的注释完整的线粒体基因组与本研究获得的4种硬皮肿腿蜂线粒体基因组，基于13个蛋白编码基因(protein-coding genes, PCGs)序列，利用贝叶斯法(Bayesian inference, BI)和最大似然法(maximum likelihood, ML)构建系统发育树，分析肿腿蜂科(Bethylidae)在针尾部中的系统发育位置。【结果】4种硬皮肿腿蜂线粒体基因组全长为15 000～16 000 bp,由37个基因组成，包括13个PCGs、 2个rRNA基因和22个tRNA基因及1个非编码控制区。13个PCGs中，使用频率较高的4种氨基酸为Ile, Leu, Phe和Met。22个tRNA基因中，仅trnS1缺失DHU臂，其余21个tRNA基因都能形成典型的三叶草结构。37个基因中共有17个基因发生基因重排，包括15个tRNA基因和2个PCGs。与其余细腰亚目(Apocrita)昆虫相比，4种硬皮肿腿蜂线粒体基因组中trnT-trnP发生基因洗牌的同时，trnT发生了基因倒置。系统发育分析结果表明，肿腿蜂科具有单系性，且硬皮肿腿蜂属和头甲肿腿蜂属Cephalonomia的亲缘关系最近。【结论】本研究提供了4种硬皮肿腿蜂的线粒体基因组特征，发现基因重排现象复杂；系统发育分析表明硬皮肿腿蜂属隶属于肿腿蜂科，支持传统形态学分类结果；肿腿蜂科具有单系性，与蚁蜂科(Mutillidae)互为姐妹群。本研究的结果为后续肿腿蜂科分类和系统发育研究奠定了基础。

摘要: 【目的】本研究旨在系统鉴定和分析西方蜜蜂Apis mellifera肽聚糖识别蛋白（peptidoglycan recognition protein, PGRP）相关基因及其剪接异构体，探析PGRP基因剪接异构体编码蛋白的理化性质和分子特征，并测定PGRP基因剪接异构体在西方蜜蜂工蜂成虫应答东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染中的表达模式，以期为西方蜜蜂PGRP基因剪接异构体的功能研究提供参考和依据。【方法】基于已获得的西方蜜蜂8和11日龄工蜂成虫中肠纳米孔测序数据，利用Blast工具将前期鉴定到的所有全长转录本分别比对到Nr和KEGG数据库，筛选出西方蜜蜂PGRP基因及其剪接异构体，并随机选择PGRP基因的5条剪接异构体通过RT-PCR验证序列的真实性。使用Gffcompare软件将鉴定到的PGRP基因序列比对至西方蜜蜂参考基因组以优化基因结构。采用Astalavista软件鉴定PGRP基因的可变剪接（alternative splicing, AS）事件类型，再通过RT-PCR和Sanger测序验证AS事件。利用相关软件预测和分析PGRP基因剪接异构体编码蛋白的理化性质和分子特征。采用RT-qPCR检测东方蜜蜂微孢子虫接种后西方蜜蜂工蜂成虫中肠中PGRP基因剪接异构体的相对表达量。【结果】共鉴定到西方蜜蜂的4个PGRP相关基因（PGRP-3,PGRP-S2,PGRP-LC和PGRP-LB）及其19条剪接异构体。通过RT-PCR与Sanger测序证实了PGRP基因5条剪接异构体（rna14029, ONT.6350.8, ONT.6350.10, rna24089和ONT.6350.7）的表达和序列真实性。PGRP-3（gene10434）的5′和3′端分别延长了8和1 055 bp,PGRP-S2（gene10435）的5′和3′端分别延长了27和234 bp。通过RT-PCR证实了PGRP-S2的AS事件的真实性。剪接异构体ONT.6350.2编码蛋白的分子式为C₉₆₆H₁₅₀₂N₂₇₂O₂₇₅S₇,分子量约为21 527.63 D,理论等电点为8.94,平均亲水性为-0.119,含有信号肽和PGRP结构域，不含跨膜结构域；剪接异构体ONT.6350.6编码蛋白分子式为C₈₄₁H₁₃₀₁N₂₄₃O₂₄₄S₅,分子量约为18 860.46 D,理论等电点9.14,平均亲水性为-0.324,不含跨膜结构域和信号肽。西方蜜蜂与东方蜜蜂A.cerana的PGRP-S2在进化树上聚为一支。相较于未接种东方蜜蜂微孢子虫的对照组，接种东方蜜蜂微孢子虫的西方蜜蜂工蜂成虫中肠中剪接异构体ONT.6350.2的表达量在接种后2和4 d时显著上调，在接种后3 d时极显著上调；剪接异构体ONT.6350.6与ONT.6350.2的表达模式相同；剪接异构体ONT.6350.2和ONT.6350.6在接种东方蜜蜂微孢子虫后1-4 d时总体上均表现为上升表达趋势。【结论】本研究优化了西方蜜蜂参考基因组上已注释的PGRP-3和PGRP-S2基因结构；揭示剪接异构体ONT.6350.2的编码蛋白可能是分泌蛋白，而剪接异构体ONT.6350.6的编码蛋白可能是胞内蛋白；西方蜜蜂与东方蜜蜂的PGRP-S2同源性最高；剪接异构体ONT.6350.2和ONT.6350.6在西方蜜蜂工蜂成虫应答东方蜜蜂微孢子虫侵染中被激活表达。

摘要: 【目的】本研究旨在通过解析意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica lncRNA15837的调控方式和作用，并检测lncRNA15837在工蜂不同发育阶段和成虫不同组织及幼虫应答蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis侵染中的表达模式，为深入探究lncRNA15837的调控功能与机制提供参考和依据。【方法】基于已获得的意大利蜜蜂7和10日龄工蜂成虫中肠高质量转录组数据，利用Miranda, RNAhybrid和TargetScan软件预测lncRNA15837靶向的miRNA及miRNA靶向的mRNA,再通过Cytoscape v3.7.1软件构建并可视化竞争性内源RNA (competing endogenous RNA, ceRNA)调控网络。使用Blast工具将靶mRNA比对至GO和KEGG数据库以获得相应的功能和通路注释。通过RT-PCR验证lncRNA15837在刚出房工蜂成虫不同组织(触角、咽下腺、脑、表皮、中肠、脂肪体和毒腺)中的表达。利用RT-qPCR检测lncRNA15837在工蜂的不同发育阶段(卵、3日龄幼虫、 1和2日龄预蛹、 4日龄蛹及1, 2, 6, 12, 15和18日龄工蜂成虫)、刚出房工蜂成虫不同组织(触角、咽下腺、脑、表皮、中肠、脂肪体和毒腺)和3日龄幼虫感染蜜蜂球囊菌后4, 5和6日龄幼虫肠道中的表达量。【结果】LncRNA15837可靶向ame-miR-21-x和ame-miR-0046-3p等29个miRNA,进而靶向1 559条mRNA,形成1个复杂的ceRNA网络；上述靶mRNA可注释到436个GO条目，其中114条靶mRNA涉及139个分子功能相关条目，115条靶mRNA涉及257个生物学进程相关条目，67条靶mRNA涉及40个细胞组分相关条目；可注释到224条KEGG通路，其中28条靶mRNA注释到内吞、吞噬细胞和溶酶体等细胞免疫通路，以及157条靶mRNA注释到JAK-STAT, Toll和Imd, NF-kappa B和Toll样受体信号通路等体液免疫通路；lncRNA15837在工蜂卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫中差异表达，在1日龄预蛹中的表达量最低，而在3日龄幼虫中的表达量最高；lncRNA15837在刚出房工蜂成虫的触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮中均有表达但表达量存在差异，在脂肪体中的表达量最低，而在毒腺中的表达量最高；相较于未接种对照组，lncRNA15837的表达量在蜜蜂球囊菌接种组4日龄幼虫肠道中表达量上调，在5和6日龄幼虫肠道中显著上调。【结论】意大利蜜蜂lncRNA15837通过ceRNA网络潜在调控胞吞作用、吞噬细胞和溶酶体等细胞免疫通路和JAK-STAT、Toll和Imd、NF-kappa B和Toll样受体信号通路等体液免疫通路；lncRNA15837在工蜂的3日龄幼虫和工蜂成虫毒腺中特异性高表达；工蜂幼虫肠道中lncRNA15837的表达被蜜蜂球囊菌侵染所激活，提示lncRNA15837是意大利蜜蜂幼虫应答蜜蜂球囊菌侵染的潜在调控因子。

摘要: 【目的】本研究旨在克隆东方蜜蜂Apis cerana基质金属蛋白酶14（matrix metalloproteinase-14, MMP14）基因AcMMP14,分析其分子特征和表达模式，为持续深入开展AcMMP14的功能研究提供参考和依据。【方法】提取东方蜜蜂6日龄工蜂幼虫肠道总RNA,PCR扩增AcMMP14的编码序列（coding sequence, CDS）。使用相关生物信息学软件预测AcMMP14的理化性质和分子特征，鉴定东方蜜蜂和其他蜂种MMP14的结构域和保守基序，并进行系统进化分析。采用RT-qPCR检测AcMMP14在工蜂卵、幼虫、预蛹、蛹和不同日龄成虫，工蜂成虫触角、脑、表皮、脂肪体、毒腺、中肠和咽下腺及东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae接种刚出房的1日龄工蜂后1-4 d时中肠中的相对表达量。【结果】AcMMP14的分子式为C₃₀₆₈H₄₅₈₁N₈₀₃O₉₁₅S₂₀,分子量约为68.00 kD,脂溶系数为64.12,等电点为5.85,平均亲水系数为-0.47,含1个信号肽和36个磷酸化位点，可同时定位于线粒体、细胞核和细胞质。东方蜜蜂与其他10种蜂的MMP14中均含有3个相同的结构域和5个相同的保守基序。东方蜜蜂与大蜜蜂A.dorsata的MMP14的氨基酸序列一致性达94.23%,且在进化树上聚为一支。AcMMP14在东方蜜蜂工蜂卵、3日龄幼虫、 1和2日龄预蛹及4日龄蛹中差异表达，在4日龄蛹中的表达量最高且显著高于3日龄幼虫和2日龄预蛹中的表达量。AcMMP14在不同日龄工蜂成虫体内差异表达，在15日龄成虫体内的表达量最高且显著高于1, 2, 6, 12和17日龄成虫体内的表达量。AcMMP14在东方蜜蜂工蜂成虫的7种不同组织中差异表达，在触角中的表达量最高且显著高于脑、表皮、脂肪体、毒腺、中肠和咽下腺中的表达量。与未接种的对照组相比，东方蜜蜂微孢子虫接种后1和2 d时工蜂成虫中肠中AcMMP14的表达量显著下调，3和4 d时工蜂成虫中肠中AcMMP14的表达量下调但差异不显著。【结论】AcMMP14为潜在的亲水性蛋白和分泌蛋白；AcMMP14在东方蜜蜂工蜂不同发育阶段和成虫组织中发挥潜在的重要功能；工蜂成虫中肠中AcMMP14在东方蜜蜂微孢子虫的第一个增殖周期前期被激活表达。