摘要: 【目的】通过RNA seq技术对纯培养的蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis孢子和球囊菌侵染的蜜蜂幼虫肠道组织进行测序,de novo组装球囊菌的参考转录组,并对其进行功能与代谢通路注释,进而基于该转录组数据开发球囊菌的SSR分子标记。【方法】首先通过差速离心获得活化的球囊菌孢子,配制含1×107孢子/m L的饲料饲喂4,5和6日龄的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼虫和中华蜜蜂Apis cerana cerana幼虫,通过Illumina Hi SeqTM2500平台同时对上述蜜蜂幼虫肠道及纯化球囊菌孢子进行深度测序,原始数据过滤后通过Trinity软件组装得到unigenes,进而通过BLASTX比对NCBI Nr,Swiss-Prot,KOG和KEGG数据库对unigenes进行功能与代谢通路注释。利用MISA软件对所有unigenes进行SSR搜索,并利用Primer Premier 5软件设计SSR特异性引物,通过PCR对不同来源的球囊菌SSR位点进行扩增。【结果】本研究共获得146 135 308条高质量reads,de novo组装得到42 609个unigenes。BLASTX比对结果显示,29 316个unigenes在上述公共数据库中具有功能和代谢通路注释。注释到法夫酵母Xanthophyllomyces dendrorhous上的unigenes最多,达6 050个。KEGG注释结果显示,unigenes可注释到117个代谢通路,其中富集在核糖体(ribosome)上的unigenes数量最多(529)。所有unigenes中共预测到7 968个SSRs,通过PCR开发出5个球囊菌SSR分子标记。【结论】本研究成功组装球囊菌的参考转录组,并进行了功能与代谢通路注释,可为在分子水平深入研究球囊菌提供重要的参考信息。基于该转录组信息开发的5个SSR分子标记可推动菌株鉴定、基因图谱构建及基因定位等研究。

摘要: 【目的】本研究旨在探究球孢白僵菌Beauveria bassiana对管氏肿腿蜂Scleroderma guani雌成蜂的不利影响,为今后利用管氏肿腿蜂携带球孢白僵菌联合防控松墨天牛Monochamus alternatus等蛀干害虫的技术研发奠定基础。【方法】本实验测定了5种不同浓度的球孢白僵菌孢悬液(1.0×1041.0×108孢子/m L)和孢子粉(1.0×107孢子/雌)(以无菌水为对照)对雌成蜂的侵染力和致死力的影响。【结果】球孢白僵菌的孢悬液和孢子粉均会感染雌成蜂,不同浓度孢悬液接种于雌成蜂体表时,孢悬液对雌成蜂的感染率和致死率均与孢悬液浓度呈正相关性。接菌第2和4天,仅最高浓度孢悬液对雌成蜂有致死和感染现象;第5天,1.0×108,1.0×106和1.0×104孢子/m L孢悬液对雌成蜂的感染率分别为56.0%,8.0%和4.0%,致死率分别为88.0%,44.0%和16.0%;第6天,1.0×108孢子/m L孢悬液对雌成蜂的致死率高达100%,是最低浓度孢悬液对雌成蜂致死率的6.25倍。同时,孢悬液和孢子粉(含相同孢子数)相比,前者对雌成蜂的致死率更高;接菌第7天,孢悬液(1.0×107孢子/m L)对雌成蜂的致死率为100%,是孢子粉的3.12倍。这可能与雌成蜂对孢子粉有一定的清理或抖落行为有关。【结论】今后在利用管氏肿腿蜂携菌防控天牛等蛀干害虫时,可优先选用球孢白僵菌孢悬液,并控制雌成蜂携菌后及时释放,以便在其感染潜伏期45 d以内,有效传至天牛蛹室。

摘要: 【目的】探究中华蜜蜂Apis cerana cerana信号识别颗粒9(signal recognition particle 9,SRP9)基因的序列,获得纯化的重组蛋白,为探究其蛋白功能奠定基础。【方法】利用RT-PCR方法,以中华蜜蜂的c DNA为模板扩增中华蜜蜂SRP9基因编码区,并通过软件MEGA5.1构建系统发育树,运用Predice Protein和SWISS-MODEL等软件预测分析蛋白结构;用大肠杆菌Escherichia coli表达系统进行原核表达;采用尿素洗脱法进行重组蛋白纯化。【结果】扩增得到的中华蜜蜂SRP9基因编码区长为237 bp,命名为Acc SRP9。该基因编码78个氨基酸,编码蛋白的相对分子量为9.36 k D,等电点为9.17。系统进化树分析表明,Acc SRP9与西方蜜蜂Apis mellifera的SRP9和小蜜蜂Apis florea的SRP9聚成一支。蛋白质二级结构预测发现其含有2个α-螺旋区和3个β-折叠区。利用同源建模获得蛋白质的三维结构。将Acc SRP9连入表达载体p GEX-6P-1并在BL21(DE3)中进行原核表达,发现该重组蛋白表达在包涵体中,经蛋白纯化,最终获得了N端带GST标签的重组蛋白p GEX-6P-1-SRP9。【结论】本研究成功克隆了中华蜜蜂SRP9基因Acc SRP9,对其序列进行了分析,并获得了带有标签的重组蛋白,为进一步研究该基因的功能提供参考和材料。

摘要: 【目的】研究地理位置接近的山地区域中华蜜蜂Apis cerana cerana的形态与遗传多样性,对开展中华蜜蜂遗传资源的保护具有重要意义。重庆多山,如大巴山、武陵山、大娄山等,当地植被茂盛、蜜源植物丰富,适宜中华蜜蜂的生存繁衍。因此,重庆中华蜜蜂是研究同一地域复杂地形下中华蜜蜂形态和遗传分化的良好对象。本研究首次全面调查重庆地区中华蜜蜂种质资源多样性,分析不同生境中华蜜蜂种质资源的分化,考察潜在的基因交流情况,为中华蜜蜂的资源保护提供参考。【方法】运用吻长、翅长、翅宽、翅面积、肘脉指数、第3、4背板长等形态指标对来自重庆不同山脉和周边地区的139群中华蜜蜂进行形态测量和统计,同时对mt DNA tRNAleuCOⅡ段非编码区序列进行PCR扩增并测序分析。【结果】形态分析显示,以亚热带季风气候为主的武陵山、大娄山地区中华蜜蜂能够区分以亚热带山地气候为主的大巴山地区聚群,以及重庆西、北部的聚群。Structure群体结构分析mt DNA非编码区单倍型序列发现,不同山地生境中华蜜蜂种群之间存在基因交流,而两大山系与重庆周边地区中华蜜蜂种群之间同样存在基因交流。此外发现了3个新的东方蜜蜂单倍型,分别是大巴山Cq H4、大娄山Cq H7、西部丘陵Cq H13。【结论】重庆中华蜜蜂不同地理种群形态发生了分化,表现出较强适应性。各山脉和地区中华蜜蜂种群之间遗传结构接近,具有共同遗传单倍型,暗示基因交流发生在不同地理种群中,导致重庆中华蜜蜂的遗传分化不明显。

摘要: 【目的】咽下腺(hypopharyngeal gland)是蜜蜂重要的外分泌腺,是工蜂合成和分泌蜂王浆的主要腺体。本研究的目的在于了解中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂咽下腺的胚后发育特点。【方法】通过组织形态学、Brd U免疫组织化学和TUNEL细胞凋亡检测等技术,对中华蜜蜂工蜂咽下腺的胚后发育过程及组织结构特点进行了比较研究。【结果】中华蜜蜂工蜂的咽下腺起源自预蛹阶段口器内壁的陷入,细胞分裂活动的高峰期集中在蛹发育的前3 d,随后分裂细胞数减少,并一直持续到蛹发育的第7天左右结束;分泌腺泡的出现大约在蛹发育的第5天。到蛹发育的末期,咽下腺已基本形成,但是没有发育完全;哺育蜂的咽下腺高度发育,分泌活动旺盛;采集蜂的咽下腺中有许多分泌细胞凋亡。【结论】本研究揭示了中蜂工蜂咽下腺胚后发育过程中细胞增殖和凋亡的模式,为昆虫咽下腺的发育和功能研究提供了一定的理论依据。