摘要: 【目的】人类C型尼曼匹克病(Niemann-Pick disease type C, NPC)主要是由NPC1基因突变引起的一类遗传疾病。NPC1蛋白主要负责胞内胆固醇运输,同时也作为病毒侵染宿主细胞的重要受体之一近年来备受关注。本研究旨在探究NPC1蛋白与中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus, CSBV)感染的关系。【方法】通过PCR扩增中华蜜蜂Apis cerana cerana AcNPC1基因;将其克隆至pET-30a原核表达载体,转化至大肠杆菌Escherichia coli Rosetta(TM)(DE3)进行IPTG诱导表达,采用镍柱纯化重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体。设计并合成AcNPC1 siRNA,添食中华蜜蜂幼虫;运用RT-qPCR检测和分析中华蜜蜂CSBV添毒幼虫中AcNPC1的表达量,以及RNAi干扰后不同时间AcNPC1基因和CSBV病毒衣壳蛋白VP1基因在感染CSBV的中华蜜蜂幼虫中的表达水平。【结果】成功构建重组表达质粒pET-30a-AcNPC1,在大肠杆菌中获得高效表达的重组蛋白,目的蛋白大小约为36 kD,经亲和纯化获得了纯度较高的重组蛋白,免疫小鼠成功制备了多克隆抗体,免疫印迹分析发现AcNPC1抗体能杂交到两条带,有可能是在提取膜蛋白过程中该蛋白发生了部分降解。中华蜜蜂CSBV添毒幼虫中AcNPC1表达与正常幼虫中的相比,在12, 24和48 h并无显著变化,在72 h出现显著上调。RNAi实验结果表明,中华蜜蜂正常幼虫添食24 h后AcNPC1的3个干涉片段(siRNA1, siRNA2 and siRNA3)均对AcNPC1具有显著性下调作用,AcNPC1表达分别下调了73.20%, 72.81%和54.78%;给CSBV添毒幼虫分别添食3个干涉片段,AcNPC1表达分别下调了43.90%, 59.85%和57.67%。CSBV VP1基因在干扰AcNPC1基因72 h后表达下调了67.65%。【结论】利用原核表达系统能有效地在体外表达中华蜜蜂AcNPC1,并制备了其多克隆抗体。利用体外合成的siRNA对中华蜜蜂幼虫中AcNPC1的表达进行干扰,表明在蜜蜂中通过饲喂的方式进行RNAi可以成功下调靶标基因表达水平。不过,RNAi实验结果提示AcNPC1表达下调后可能并不直接影响CSBV的感染。本研究为进一步阐明AcNPC1的潜在功能打下了基础。

摘要: 【目的】利用已获得的纳米孔长读段测序数据完善现有的蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis参考基因组注释信息,并对未注释的新基因和新转录本进行鉴定和功能注释。【方法】基于已获得的纳米孔长读段测序数据,采用gffcompare软件将蜜蜂球囊菌全长转录本与参考基因组注释的转录本进行比较,进而对参考基因组注释基因的非翻译区(untranslated region, UTR)进行延长。利用TransDecoder软件对蜜蜂球囊菌基因的开放阅读框(open reading frame, ORF)及相应的氨基酸序列进行预测。通过MISA软件发掘长度在500 bp以上的全长转录本的SSR位点。通过Blast工具将鉴定到的新基因和新转录本比对Nr, KOG, eggNOG, Swiss-Prot, Pfam, GO和KEGG数据库进行功能注释。【结果】共对蜜蜂球囊菌的9 481个基因进行了UTR延长,其中5′UTR和3′UTR延长的基因分别有4 744和4 737个。共预测出10 492个完整ORF,其中编码长度分布在0100和100200个氨基酸的ORF最多,分别占ORF总数的38.96%和36.90%。共鉴定到5 286个SSR,其中单核苷酸重复、二核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、五核苷酸重复和六核苷酸重复的SSR分别为1 870, 826, 2 398, 138, 43和11个。共鉴定到1 558个新基因,其中有1 556, 731, 330, 592, 1 177, 709和589个新基因可分别被注释到Nr, Swiss-Prot, Pfam, KOG, eggNOG, GO和KEGG数据库。此外,还鉴定到14 403条新转录本,其中有14 376, 8 524, 7 276, 7 405, 12 035, 7 891和6 855条新转录本可分别被注释到上述7个数据库。【结论】本研究利用已获得的纳米孔长读段测序数据对蜜蜂球囊菌的完整ORF进行了预测,对参考基因组的已注释基因进行了UTR延长,对未注释的SSR位点进行了发掘,此外还鉴定到大量未注释的新基因和新转录本,并对它们进行了功能注释。研究结果较好地完善了现有的蜜蜂球囊菌的基因组注释,为其组学和分子生物学研究的深入开展提供了基础。

摘要: 【目的】利用11对微卫星标记对湖南龙山中华蜜蜂Apis cerana cerana种群遗传多样性进行分析,评估种群内遗传变异和种群间的遗传分化。【方法】从湖南省龙山县采集不同海拔(1 080和665 m)中华蜜蜂各30群,共60群。从每群1020头成年工蜂中随机挑选1头提取DNA作为模板,利用11对微卫星引物进行PCR。基于PCR扩增产物,通过Microsatellite-Toolkit软件计算高海拔种群(G)和低海拔种群(D)各基因位点的优势等位基因频率(Pi)、期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC)。根据FSTAT程序计算种群内近交系数(Fis)。用SPSS 25.0软件分析两个种群(G和D)间Pi,He,PIC和Fis的差异显著性。【结果】湖南省龙山县中华蜜蜂高海拔种群(G)和低海拔种群(D)的Pi分析表明,两个种群均具有较高的遗传多样性;高海拔种群的He,PIC和Fis平均值分别为0.593, 0.556和0.121,均略低于低海拔种群的0.631, 0.587和0.187。两个种群间Pi,He,PIC和Fis无显著性差异(P_(Pi)=0.721>0.05,P_(He)=0.759>0.05,P_(PIC)=0.802>0.05,P_(Fis)=0.767>0.05)。【结论】位于武陵山区龙山县地域高海拔与低海拔中华蜜蜂种群具有较高遗传多样性,但遗传分化程度不高,提示海拔因素可能不直接影响中华蜜蜂种群遗传多样性。

摘要: 【目的】烟蚜Myzus persicae是烟草上重要的害虫之一,烟蚜茧蜂Aphidius gifuensis是烟蚜的一种优势寄生蜂。本研究旨在筛选出可延迟烟蚜茧蜂羽化时间的最佳保幼激素,解决规模化繁殖过程中出现的烟蚜茧蜂羽化不一致、不整齐,生产上急需烟蚜茧蜂防控烟蚜时所需烟蚜茧蜂数量不足而影响防蚜效果等严重问题。【方法】利用液浸法测定了不同浓度(5 000,1 000,200,40和8 ng/μL)的5种保幼激素类似物包括稀虫乙酯(ZR-512)、稀虫炔酯(ZR-777)、稀虫酯(ZR-515)、苯氧威[(对苯氧乙基)氨基甲酸乙酯)]和保幼激素Ⅲ(2,6-壬二烯酸)处理后对烟蚜茧蜂羽化率、羽化时间、成蜂寿命、雌蜂比例和寄生率的影响;通过生物化学方法测定1 000 ng/μL这5种保幼激素类似物处理后烟蚜茧蜂蛹内与蜕皮相关酶含量和活性,筛选能延迟烟蚜茧蜂羽化时间的最佳保幼激素类似物。【结果】测试的不同浓度的5种保幼激素类似物中200 ng/μL ZR-777和1 000 ng/μL ZR-512处理后能显著延迟烟蚜茧蜂羽化时间,分别比对照(10%丙酮处理)延迟了44.00和56.00h;不同浓度的ZR-515和苯氧威处理后烟蚜茧蜂羽化率较对照组显著降低。与对照组相比,测试的不同浓度的5种保幼激素类似物对成蜂寿命均没有显著影响; 1 000和40 ng/μL ZR-777处理显著降低了雌蜂比例。200 ng/μL ZR-777,1 000 ng/μL ZR-512和5 000 ng/μL ZR-512处理对烟蚜茧蜂的寄生率无显著影响。5种保幼激素类似物以1 000 ng/μL浓度处理时,ZR-512处理组中烟蚜茧蜂蛹内酚氧化酶含量和活性以及几丁质酶活性均最低。【结论】生产上可用1 000 ng/μL ZR-512和200 ng/μL ZR-777处理烟蚜茧蜂,以达到调控烟蚜茧蜂羽化时间,取得足量、一致的烟蚜茧蜂。结果为烟蚜茧蜂规模化繁殖提供了理论依据。

摘要: 【目的】为探究烟蚜茧蜂Aphidius gifuensis对烟蚜Myzus persicae寄生后烟蚜生长发育和繁殖影响及其在烟蚜防控中的作用。【方法】采用室内叶片培养皿法,测定了不同龄期烟蚜(1-4龄若蚜及成蚜)被烟蚜茧蜂寄生后烟蚜当代(F_0)及后代(F_1)的发育历期、寿命、产仔量。【结果】烟蚜1龄若蚜被烟蚜茧蜂寄生后,1龄若蚜历期受到显著影响,较未被寄生对照缩短了0.65 d (33.00%),而2-4龄若蚜期和成蚜历期未受显著影响; 2龄若蚜被寄生后,4龄若蚜和成蚜历期均受到显著影响,较未被寄生的对照分别缩短了1.50 d (100.00%)和0.83 d (100.00%),而2和3龄若蚜期未受显著影响; 3龄若蚜被寄生后,4龄若蚜和成蚜期均受到显著影响,较未被寄生对照分别缩短了1.50 d (100.00%)和0.83 d (100.00%),而3龄若蚜期未受显著影响。2龄若蚜被寄生后烟蚜的寿命和产仔量均受到显著影响,寿命较未被寄生对照缩短了8.39 d(54.00%),每雌产仔量较未被寄生对照减少了48.67头(100.00%)。此外,2-3龄若蚜被寄生后其后代(F_1) 1龄若蚜历期受影响最大,较未被寄生烟蚜后代1龄若蚜期缩短了0.80 d(40.00%),其F_1代平均寿命较未被寄生烟蚜后代平均寿命延长了5.72 d(41.20%),但其产仔量与对照差异不显著。【结论】不同龄期烟蚜被烟蚜茧蜂寄生后,其发育历期和寿命比未被寄生的缩短,产仔量比被未寄生的少,但其F_1代平均寿命比未被寄生后代烟蚜的长且其产仔量未受显著影响。当代2龄若蚜期是控制烟蚜增长的关键时期。这些结果对确定烟蚜茧蜂防治烟蚜适期及认识其机理具有重要参考意义。