摘要: 【目的】吡哆醛激酶(pyridoxal kinase,PLK,EC2.7.1.35)是维生素B6的关键代谢酶。本研究原核表达家蚕Bombyxmori重组PLK,为进一步开展家蚕PLK的催化作用机制和表达调控机制的研究奠定基础。【方法】构建家蚕PLK基因融合表达质粒,转化大肠杆菌Escherichia coli诱导表达,经Ni2+亲和层析纯化后,对融合蛋白的催化活性进行分析。【结果】纯化后的家蚕重组PLK经SDS-PAGE鉴定为单一条带,比活力为1800U/mg,纯化倍数为40倍。在底物过量的条件下,该重组酶的体外最适反应温度是50℃;最适pH为5.56;Zn2+是酶促反应有效的激活剂。【结论】重组家蚕PLK与来源于家蚕组织的PLK具有相同的催化性质。

摘要: Hox基因(homeobox genes)在昆虫躯体模式(bodyplan)的发育调控机制中扮演着重要角色,其表达具有严格的组织特异性和胚胎发育的程序性。家蚕Bombyxmori作为鳞翅目昆虫的代表,其Hox基因也陆续得到鉴定。在家蚕中存在一个拟复等位基因群——E群基因,其突变表型均与过剩斑纹和过剩附肢有关,这可能与Hox基因有着密切联系。家蚕全基因组测序完成后,发现其Hox基因簇中存在12个特有的homeobox基因(Bmshx1Bmshx12),说明家蚕Hox基因可能具有独特的生物学意义。我们还利用家蚕基因芯片数据分析了Bmlab与Bmpb基因的组织表达特征。通过对家蚕Hox基因的研究,探索家蚕躯体模式建立机制,可望为解析其他鳞翅目昆虫的躯体模式的建立机制提供理论依据。本文就家蚕Hox基因的表达、功能及其与E群突变的关系等方面进行了综述。

摘要: 精巢是雄性家蚕Bombyxmori的生殖腺,它的主要功能是产生精子,全面检测和鉴定精巢器官的蛋白分布将为分析家蚕雄性个体的发育和繁殖奠定基础。本研究利用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白硝酸银染色技术对家蚕5龄第5天幼虫的精巢组织进行了蛋白检测,利用基质辅助激光解析质量飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对表达量较高的蛋白点进行了肽质量指纹图谱鉴定。结果表明:家蚕精巢蛋白质可以检测出1000个以上的蛋白点,这些蛋白点主要集中在分子量为1590kD区域,等电点3.59之间,其中60个蛋白点得到了成功鉴定,按照已知或推测的蛋白功能,将其分为8类,包括:细胞骨架和细胞结构蛋白,膜蛋白或信号相关蛋白,大量应激反应蛋白(伴侣蛋白),线粒体和能量产生相关蛋白,转录调控和翻译及DNA/RNA结合相关蛋白,酶和少量血液组成蛋白。其中很多蛋白可能在鞭毛形成、能量代谢及减数分裂过程中有重要作用。这些结果为进一步认识家蚕精子形成过程提供了重要的生物学信息。

摘要: 3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)是真核细胞的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性酶,具有能量传递等重要功能。家蚕Bombyxmori是重要的变态和能量代谢研究模式动物,为了明确GPDH在家蚕中的作用,本研究根据果蝇lethal(2)k05713的蛋白质序列,从家蚕C108品种克隆了2个完整的mRNA转录体,长度分别为3456bp和2979bp(GenBank登录号为GQ865685和GQ865686),具有相同的2166bpORF,编码721个氨基酸。克隆拼接了548bp的第9内含子后,参照大造品种的全基因组数据,推测出BmGpd基因全长27983bp(GenBank登录号为EF154335),包含16个外显子和15个内含子。编码蛋白具跨膜螺旋结构,pI为8.22,分子量为80.5kD,120氨基酸区域为信号肽序列。分子同源进化和蛋白质基序分析表明,BmGPD是家蚕中一种新GPDH成员,能在大肠杆菌Escherichiacoli中诱导大量表达。RT-PCR分析表明,BmGpd基因表达量在5龄中期最高,在3d的蛹中明显下调,进入滞育时表达量更低;血液中较低,中肠、丝腺、生殖腺和脂肪体中有大量表达。芯片表达谱显示,5龄第3天幼虫头和体壁中表达丰度最高,脂肪体和马氏管中最低,性别差异不显著。EST表达谱显示,4龄第2天中肠中表达丰度最高。RNAi结果显示,家蚕体内存在BmGpd基因产物代谢补偿途径。本研究为深入研究家蚕GPDH的表达调控以及与变态和能量代谢的关系创造了条件。

摘要: 为筛选出一个较强的启动子用于提高转座子piggyBac在家蚕Bombyx mori细胞中的转化效率,采用双荧光素酶报告基因检测(dual-luciferase reporter assay)技术比较了热激蛋白启动子(hsp70和hsp82)、家蚕肌动蛋白启动子(A3)、多聚泛素(polyubiquitin)启动子(PUB)、α微管蛋白启动子(α-tub)、丝素轻链启动子(Fib-L)、人工合成启动子3×P3及苜蓿丫纹夜蛾多角体病毒(AcNPV)增强子-启动子组合(hr5-IE1)8种启动子在家蚕细胞株BmN内的活性。结果显示hr5-IE1活性最强,A3次之,其余启动子活性均较弱。构建含有hr5-IE1启动子和piggyBac的转座酶编码区的质粒作为辅助质粒,与EGFP载体质粒一起转染家蚕细胞后,实现了EGFP基因整合到细胞基因组中。因此,今后可考虑将hr5-IE1用于家蚕细胞遗传转化的研究中,以提高细胞转化的效率。