摘要: 细胞色素P450(P450s,CYPs)超基因家族是由数量众多、功能复杂的一类血红蛋白酶基因所组成,对许多结构多样的外源与内源化合物起着氧化代谢的作用。本文系统地综述了家蚕Bombyx mori基因组中P450s的数量与种类,其数量比食腐昆虫和杂食性的植食昆虫少,但比意大利蜜蜂Apis mellifera多,在基因组中大多呈串联重复排列,基因结构与系统进化树之间有着紧密的联系。家蚕与黑腹果蝇Drosophila melanogaster P450s的比较基因组学分析发现,存在10对直向同源基因,但CYP3与CYP4集团(Clan)的P450s表现出种属特异性扩增。家蚕P450s与其蜕皮激素和保幼激素合成代谢有关,并涉及到对氟化物与杀虫剂抗性。家蚕作为鳞翅目昆虫的代表,通过对其P450s的研究,可望为其他昆虫,特别是鳞翅目昆虫的生长发育研究和抗性治理提供理论依据和研究模式。

摘要: RNA和输出因子结合蛋白(RNA and export factor binding proteins,REF/Aly)参与RNA的稳定、加工和输出。本研究参照已公开的家蚕Bombyx mori aly序列(GenBank登录号:DQ497195.1),通过RT-PCR克隆了家蚕aly/ref基因(Bmaly/ref)。测序结果显示,该基因的开放读码框为765bp,编码254个氨基酸残基,BmAly/REF与黑腹果蝇Drosophila melanogaster、小鼠Mus musculus的同源体的氨基酸序列一致性分别为49.7%和52.7%。结构预测结果显示,BmAly/REF具有REF家族的与RNA结合的结构域RRM,N和C端分别具有REF-N和REF-C基序。进化分析结果显示,昆虫的ALY/REF聚为一类,BmAly/REF与赤拟谷盗Tribolium castaneum、意大利蜜蜂Apismellifera的Aly/REF较为接近。将Bmaly/ref基因克隆进pGS21a(+)载体进行原核表达,重组蛋白免疫小鼠,获得鼠抗BmAly/REF多抗。免疫荧光实验结果显示,BmAly/REF在细胞质和细胞核中均有分布,但主要分布在细胞核中。芯片数据分析显示Bmaly/ref基因在家蚕幼虫5龄第3天各组织中均有较高水平的表达。研究结果显示BmAly/REF可能在RNA的核输出方面发挥作用,为进一步探讨BmAly/REF的功能奠定了基础。

摘要: 为了阐明蚕丝蛋白基因表达调控的分子机制,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统及实时荧光定量PCR等技术,对家蚕Bombyx mori丝素P25基因启动子上游1233bp的活性及其调控元件的功能进行了分析。结果表明:在P25启动子上游-423-1233区和-127-238区存在正调控元件,在-238-423区段存在负调控元件;PSGF和BMFA两结合元件在P25基因表达中起负调控作用。PSGF结合元件对A3启动子在后部丝腺的活性具有一定的增强作用,进一步验证了PSGF调控元件的功能。通过对P25基因启动子的活性分析,尤其是对PSGF和BMFA调控元件的功能分析,有利于进一步了解P25基因表达调控的精细机制。

摘要: 昆虫羧酸酯酶是一类能对外源化合物解毒和气味分子降解的重要酶系。本研究选取在家蚕Bombyx mori幼虫嗅觉感器中有表达,并与蛀茎夜蛾Sesamia nonagrioides触角酯酶基因Snon-EST可能为直系同源基因的Bmae35进行克隆和外源表达研究。结果表明:该基因编码区长1581bp,共编码526个氨基酸。与其他昆虫触角酯酶的多序列比对分析发现,Bmae35编码的蛋白具有酯酶活性必须的催化残基Ser191,Glu313和His429,也保持着α-酯酶家族特征基序Gly-x-Ser-x-Gly。RT-PCR分析显示,Bmae35在家蚕5龄第3天各组织中均有表达,其中在头、脂肪体、马氏管、体壁和丝腺中的表达量较高。Bmae35在雌蛾性信息腺中表达,并与性信息素合成呈正相关,暗示其在信息素合成中起重要作用。构建Bmae35与pET28(a)重组载体,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导,电泳检测发现该基因以包涵体形式表达,以镍亲和层析柱纯化,Western blotting鉴定证实Bmae35在大肠杆菌Escherichiacoli中正确表达并得以纯化。本实验通过对家蚕Bmae35基因的克隆、原核表达与纯化,为进一步深入研究其表达定位和气味降解等功能奠定基础。

摘要: 丝氨酸蛋白酶抑制剂4(serpin-4)为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一员。本研究旨在研制高效价的家蚕Bombyxmoriserpin-4多克隆抗体,为深入研究serpin-4基因的生理功能打下物质基础。首先于家蚕脂肪体中克隆了serpin-4基因,利用基因重组技术构建了pET28a-serpin-4原核表达载体,经IPTG诱导,获得原核表达重组融合蛋白,利用镍柱回收纯化技术,获得目的蛋白;经SDS-PAGE和抗His多抗检测,纯化蛋白的分子量大小与预测的一致,即获得了高纯度的目的蛋白,以此蛋白为免疫抗原,采用4次免疫方式对昆明小鼠进行抗原免疫,最终获得抗serpin-4的多克隆抗体血清;该血清经ELISA和Westernblot验证,效价达到1:20000,特异性较好。家蚕serpin-4多克隆抗体的成功制备,一方面表明应用于其他生物的多克隆抗体制备所采用的方法对于家蚕serpin基因的研究同样适用;另一方面,也为深入研究家蚕serpin-4的生理功能打下了物质基础。