摘要: 【目的】家蚕微孢子虫Nosema bombycis ADP/ATP转运蛋白可能参与搬运宿主细胞的能量。本研究克隆家蚕微孢子虫ADP/ATP转运蛋白基因,并进行原核表达、抗体制备及间接免疫荧光定位,为控制和防治家蚕微粒子病提供理论基础。【方法】通过同源序列比对鉴定家蚕微孢子虫N.bombycis ADP/ATP转运蛋白序列,采用生物合成的方法将编码3段面向膜内侧肽段的核酸序列拼接合成,在其两端引入BglⅡ和SalⅠ酶切位点,克隆至pUC57载体并测序,再亚克隆至含有二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)标签的表达载体pQE40中,然后利用BamHⅠ和SalⅠ酶切获得含有DHFR标签的重组序列,并连接至pET30a(+)载体中进行诱导表达。通过SDSPAGE、镍柱亲和层析和免疫印迹法鉴定表达蛋白,利用间接免疫荧光对ADP/ATP转运蛋白的分布进行检测。【结果】家蚕微孢子虫的ADP/ATP转运蛋白编码序列(GenBank登录号为EOB13854.1)全长1 524 bp,编码蛋白含有507个氨基酸残基,预测分子质量为59 kDa,等电点为9.35。具有12个跨膜结构域和TLC结构域,其中TLC结构域含有4个功能保守位点。与蜜蜂微孢子虫的ADP/ATP转运蛋白比较,氨基酸序列一致性达30%。系统进化分析表明微孢子虫ADP/ATP转运蛋白聚为一类,具有共同的起源。成功构建了NbADP/ATP-△TM-DHFR-pET30a原核表达重组质粒,目的基因获得表达,其融合蛋白分子量约为37 kDa,纯化重组蛋白并制备了多克隆抗体。免疫印迹分析表明,成熟微孢子虫中表达ADP/ATP转运蛋白;间接免疫荧光定位结果显示,家蚕微孢子虫孢子ADP/ATP转运蛋白定位于孢子质膜上。【结论】本研究将为阻断微孢子虫能量来源,达到控制和防治家蚕微粒子病提供新的思路。

摘要: 【目的】普遍存在于鳞翅目昆虫中的ENF肽具有非常相似的结构和生理功能,对昆虫的发育、免疫、应激反应等方面都起着重要的调控作用。有研究报道,作为ENF肽家族成员之一的家蚕Bombyx mori麻痹肽(paralytic peptide,PP)通过激活MAPK来调控家蚕的免疫应答,但其完整的分子作用机制尚不明确。本研究旨在解析传递家蚕PP免疫诱导信号的分子通路。【方法】首先通过荧光定量PCR检测了多种昆虫细胞系在PP诱导下抗菌肽基因的转录水平,并利用Western-blot检测p38 MAPK的磷酸化水平,然后利用不同信号传递分子的抑制剂处理BmE细胞筛选参与传递PP免疫诱导信号的分子。【结果】PI3K抑制剂LY294002和受体型酪酸激酶抑制剂Genistein抑制了PP对BmE细胞抗菌肽基因表达的诱导作用;且BmE细胞和家蚕血细胞在PP的诱导下,Akt和大小约为70 kDa的细胞膜蛋白均出现磷酸化水平的动态变化。【结论】PI3K/Akt信号通路和Genistein敏感性的受体型酪氨酸激酶介导了PP免疫诱导信号的传递。

摘要: 【目的】探讨鳞翅目模式昆虫家蚕Bombyx mori作为重金属污染的监测指示生物在镉胁迫下的酶反应及相关的基因表达。【方法】给家蚕幼虫期全龄添食镉(Cd2+),调查不同性别家蚕5龄幼虫脂肪体中脂质过氧化物丙二醛(MDA)的含量,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性及其基因表达水平的变化。【结果】Cd2+胁迫对雌雄家蚕MDA含量均具有浓度效应关系,MDA含量随Cd2+胁迫浓度的升高而增加。Cd2+胁迫下,SOD和CAT活性表现为先升后降的变化趋势,Pearson相关性分析显示SOD和CAT活性变化有显著相关性(雄:R=0.770,P=0.001;雌:R=0.854,P=0.000)。雌性家蚕脂肪体中CAT活性变化和Cat mRNA水平的表达具有正相关性(R=0.712,P=0.003)。雄性家蚕脂肪体中GSH-Px活性随Cd2+胁迫浓度的升高而增加,显示浓度-效应关系,12.550 mg/kg Cd2+胁迫组GSH-Px活性与对照相比有显著差异(P<0.05),其活性和GSH-Px mRNA水平的表达具有正相关性(R=0.834,P=0.000);雌性家蚕脂肪体中GSH-Px活性表现为先升后降的变化趋势,12.5 mg/kg Cd2+胁迫组GSH-Px活性与对照相比有显著增加(P<0.01)。【结论】结果表明,急性镉胁迫对家蚕脂肪体有明显的毒性作用,其作用机制与脂质过氧化加剧和抗氧化酶活性变化有关。家蚕对重金属镉的解毒机制有性别相关性。

摘要: 【目的】研究氟化物对家蚕Bombyx mori肠道内留存产酶菌的影响,有助于了解家蚕耐氟和氟敏品种的耐氟力差异。【方法】分别给家蚕耐氟品种T6和氟敏品种734添食NaF溶液浸泡后的新鲜桑叶,至5龄第3天取材。采用筛选培养基筛选产蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、淀粉酶的菌株,并结合16S rDNA系统发育关系,对菌株进行分类鉴定。【结果】家蚕肠道内产消化酶细菌有芽孢杆菌属Bacillus、葡萄球菌属Staphylococcus、肠杆菌属Enterobacter和不动杆菌属Acinetobacter和微小杆菌属Exiguobaterium,其中芽孢杆菌Bacillus sp.、葡萄球菌Staphylococcus sp.和不动杆菌Acinetobacter sp.细菌可同时产4种酶。氟中毒后T6肠道内产酶菌由5种减少到4种,734肠道内产酶菌由2种减少到1种。【结论】家蚕肠道内留存的产酶菌与家蚕自身的耐氟能力相关。

摘要: 【目的】建立一种简便、快速且能大量获得家蚕素Ⅱ(bombyxin-Ⅱ,BBXⅡ)的有效方法。【方法】运用RTPCR技术得到bombyxin-Ⅱ基因全长cDNA序列,采用原核表达技术对该基因进行异源表达,并利用亲和层析的方法得到纯化的BBXⅡ蛋白。【结果】从家蚕Bombyx mori头部mRNA中经过反转录获得bombyxin-Ⅱ基因的cDNA,并构建了原核表达载体pET28a-BBXⅡ,经过异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,使BBXⅡ获得了大量表达,进一步用HisTrap HP亲和层析,成功得到大量纯化的BBXⅡ。【结论】本实验建立的原核表达方法和蛋白纯化技术,是大量制备BBXⅡ的一种简易而有效的方法,为进一步开展BBX的分泌机制和作用机理研究,以及利用原核表达系统研发BBX降血糖药物奠定了基础。