摘要: 【目的】家蚕Bombyx mori微粒子病是蚕业生产上的毁灭性病害,家蚕微孢子虫Nosema bombycis是该病的病原,可经卵垂直传播和经口水平传播。为了探索家蚕微孢子虫中对重复元件的抵御以及对基因转录调控的潜在方式,本研究拟在基因组水平上对该物种的小RNAs进行全面系统的分析,鉴定与转座子相关的小RNAs和潜在的miRNAs。【方法】从感染家蚕微孢子虫的家蚕中肠中提取总RNA,分离小片段RNA并反转录后,进行Solexa高通量测序。通过生物信息学方法对小RNAs进行分类及功能注释,鉴定起源于家蚕微孢子虫不同类型转座子的小RNAs,并对潜在的miRNA进行预测分析。【结果】家蚕微孢子虫小RNAs的长度主要是24和25 nt,其中大部分序列表现出5'末端的尿嘧啶偏好性。家蚕微孢子虫中存在丰富的与转座子相关联的小RNAs,并且与转座子标准序列匹配的反义小RNAs明显多于正义小RNAs。同时,鉴定获得了31个候选miRNAs,部分为Nosema属的其他孢子虫中所共有,暗示其在微孢子虫基因组进化上具有保守性。【结论】首次鉴定到家蚕微孢子虫的转座子相关性小RNAs,暗示小RNAs在家蚕微孢子虫基因组对转座子防御过程中起到作用,31个潜在的miRNAs为家蚕微孢子虫miRNAs的功能验证提供了后续靶标。

摘要: 【目的】家蚕Bombyx mori核型多角体病毒(Bm NPV)核衣壳蛋白VP39为病毒装配所必需。本研究旨在初探VP39在病毒侵染家蚕细胞过程中的功能及特征,以期为家蚕抗病毒研究提供研究基础。【方法】本研究通过构建原核表达载体,诱导原核表达得到多克隆抗体,以Western blot验证VP39表达时相;构建真核表达载体,转染细胞后以免疫荧光手段观测VP39表达定位及影响病毒增殖现象。【结果】制备了VP39多克隆抗体。VP39在病毒感染后大量定位于家蚕细胞核,部分定位于胞质,而过表达的VP39定位于家蚕细胞胞质;过表达VP39后抑制Bm NPV感染家蚕细胞。【结论】在Bm N-SWU1细胞中过表达VP39会影响Bm NPV的扩散,导致Bm NPV感染细胞数目大量减少。该结果为VP39调控宿主与病毒的相互作用提供了新的思路。

摘要: 【目的】探讨DNA甲基化及组蛋白乙酰化是否参与家蚕Bombyx mori免疫反应的调控。【方法】对家蚕与其他生物的DNA甲基转移酶(DNMT)、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)与组蛋白乙酰转移酶(HAT)的蛋白序列进行系统进化分析;利用定量PCR检测家蚕5龄第3天幼虫感染病原菌绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus后Bm DNMT1,Bm HDACI-1,Bm HDACI-2和Bm HAT1在家蚕脂肪体组织中的表达变化;给家蚕5龄第2天幼虫注射DNMT,HDAC和HAT抑制剂,观察它们对家蚕感染细菌后的存活率的影响。【结果】系统进化分析显示,Bm DNMT1在进化上呈现特殊性,独立于其他昆虫DNMT1的进化,而Bm HDACs和Bm HAT在进化上相对保守。定量PCR检测表明,在两种细菌感染后,Bm DNMT1,Bm HDACs和Bm HAT1在家蚕幼虫脂肪体中的表达水平均有不同程度的上升。然而,DNMT,HDAC和HAT抑制剂对家蚕幼虫感染细菌后的存活率并无明显影响。【结论】本研究发现感染绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌后,家蚕幼虫脂肪体中Bm DNMT1,Bm HDACs和Bm HAT1的表达水平有不同程度的上调,推测DNA甲基化和组蛋白乙酰化/去乙酰化可能参与家蚕免疫反应的调控。

摘要: 【目的】本研究旨在克隆获得家蚕Bombyx mori Caspase家族基因,并通过RNAi技术初步分析其在家蚕细胞水平细胞凋亡中的功能。【方法】用c DNA末端快速扩增方法(rapid amplification of c DNA ends,RACE)克隆家蚕Caspase家族一个新基因,用RNAi和流式细胞术初步分析该基因在家蚕细胞凋亡中的功能。【结果】将克隆获得的家蚕Caspase家族基因命名为Bm Caspase-X,其全长为2 105 bp,开放阅读框长为1 494 bp,编码497 aa,分子量为57.8 k Da,等电点为5.29。Bm Caspase-X含有Caspase特有的结构位点。系统进化分析表明,Bm Caspase-X与家蚕ICE同其他昆虫Caspase-4同源物先聚在一起,再与具有长前体结构域的昆虫其他因子聚为一类。RNAi初步结果显示该基因干扰后没有出现明显的细胞凋亡。【结论】Bm Caspase-X具有典型Caspase特征,属于Caspase家族成员。目前RNAi实验结果表明Bm Caspase-X未能引起家蚕细胞凋亡的改变。本文为进一步研究该基因的功能奠定基础。

摘要: 【目的】非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)在家蚕Bombyx mori发育过程中具有重要调控作用。本研究旨在探索ncRNA参与家蚕神经系统发育的分子机理。【方法】采用实时荧光定量PCR技术对22个中等长度的ncRNA及3个ncRNA的邻近编码基因在家蚕幼虫神经系统中的表达水平进行检测。【结果】8个ncRNA(包括1个C/D box snoRNA,4个H/ACA box snoRNA和3个不能归类的ncRNA)在家蚕5龄幼虫神经组织和非神经组织中均有表达,且在胸腹神经中的表达量明显高于头部神经中的表达量。其中,snoRNA Bm-51,Bm-18和Bm-86在胸腹神经中的表达量分别是头部神经中的23,5和4.7倍。进一步研究发现,这3个内含子起源的ncRNA与其宿主基因在家蚕神经系统中的表达趋势一致,宿主基因在胸腹神经中的表达量也明显高于头部神经中的表达量。【结论】本研究筛选到的在家蚕不同神经部位存在差异表达的ncRNA,特别是在胸腹神经中高表达的ncRNA可能协同其邻近编码基因,参与家蚕神经发育或神经活动过程。该结果为研究ncRNA参与家蚕神经系统发育提供了分子依据,为从非编码RNA角度探索鳞翅目害虫防治提供了新的思路。