摘要: 【目的】研究双重氧化酶(dual oxidase,DUOX)在家蚕Bombyx mori中的表达模式,探析其在家蚕肠道免疫机制中的作用。【方法】通过氨基酸多重序列比对和系统进化分析对Bm DUOX蛋白氨基酸序列特征进行研究,并采用RT-PCR方法扩增获得家蚕Bm DUOX膜外部分Bm DUOX_OM基因序列。在大肠杆菌Eescherichia coli(DE3)中诱导表达并通过亲和层析法纯化获得重组表达蛋白,以其为抗原免疫昆明鼠,获得对应的多克隆抗体;利用所得的抗体检测Bm DUOX的表达和细胞定位。通过半定量RT-PCR方法分析Bm DUOX在家蚕不同发育时期和组织中的表达模式及病原诱导表达谱。另外,利用活性氧检测试剂盒分析家蚕微孢子虫Nosema bombycis诱导后家蚕Bm E细胞的活性氧(ROS)的含量。【结果】生物信息学分析表明,Bm DUOX内有保守的Peroxidase,Ferric_reduct,EF-hand,FAD-binding和NAD-binding结构域,且具有6个跨膜区,跨膜形式与人类Homo sapiens、果蝇Drosophila melanogaster等的DUOX蛋白的跨膜形式一致。多重序列比对分析表明,Bm DUOX的过氧化酶区域内具有过氧化物酶的保守活性位点。克隆获得家蚕Bm DUOX_OM基因,并纯化获得重组表达蛋白,制备的鼠多抗具有较好的特异性。间接免疫荧光实验(IFA)表明,Bm DUOX位于家蚕Bm E细胞的细胞膜上。表达模式分析表明,Bm DUOX在家蚕5龄第3日幼虫和成虫中表达量较高;且在幼虫表皮、精巢、卵巢和头内高量表达,在成虫的卵巢、精巢、表皮和脂肪体内也有较高的表达量。病原诱导分析表明,通过肠道起始感染的家蚕微孢子虫能够诱导家蚕幼虫中肠Bm DUOX基因持续上调表达,且其诱导后的Bm E细胞内活性氧含量也明显增加,提示Bm DUOX调控的肠上皮ROS应答参与抵抗家蚕微孢子虫的侵染。【结论】Bm DUOX含有典型的结构域及保守的活性位点,表明其在家蚕中具有保守的生物学功能。Bm DUOX在家蚕不同发育时期、不同组织及病原诱导下的表达谱提示其可能参与宿主肠上皮对家蚕微孢子虫的免疫反应。

摘要: 【目的】麻痹肽(paralytic peptide,PP)是一种在鳞翅目昆虫血淋巴中鉴定到的Glu-Asn-Phe(ENF)肽,将其注入幼虫体内会引发快速僵化的紧张性收缩。本研究旨在确定PP引起家蚕Bombyx mori幼虫活体收缩的最适剂量和最大收缩幅度,并检测诸如背血管搏动速率和离子浓度等可能伴随收缩现象的其他生理指标的变化。【方法】向家蚕5龄幼虫注射不同剂量的PP后,监测其体长收缩幅度和背血管博动速率,并用原子吸收光谱测定血淋巴、脂肪体和肠道的离子浓度。【结果】浓度为50 ng/g动物时,PP引发最有力收缩且不会导致家蚕死亡。最大收缩出现在注射后45 min内,同时肠道出现不正常扭曲以及背血管脉动速率下降。此外,细胞外Ca(2+)是收缩所必需的,PP刺激还导致血淋巴中Cl-浓度急剧下降而后缓慢恢复。【结论】PP的致麻痹活动不仅引起身体收缩,还会影响家蚕幼虫的肠道和背血管的脉动,而且破坏Cl-的体内平衡。研究结果为在动物模型中研究PP的生理功能提供参考。

摘要: 【目的】发现昆虫精巢干细胞自我更新相关基因3'UTR上的保守miRNA靶位点,为深入研究昆虫精子发生进程中的miRNA-基因调控关系提供参考。【方法】使用Blast搜索27种全变态昆虫精巢干细胞自我更新相关基因,并预测这些基因的3'UTR。使用Target Scan预测这些基因3'UTR上的miRNA靶位点。对家蚕Bombyx mori和小菜蛾Plutella xylostella的Chinmo和Imp基因包含let-7-5p靶标点的3'UTR序列进行了克隆,使用双荧光素酶报告系统对其靶标关系进行验证。【结果】在27种全变态昆虫中发现了17个精巢干细胞自我更新相关基因。利用Target Scan在这些基因的3'UTR上预测到了203个保守的miRNA靶位点。其中Zfh-1,Chinmo,Ken及Imp的3'UTR上存在大量的miRNA靶位点,但miRNA靶位点数目在不同昆虫类群中也存在很大差异。其中,Chinmo及Imp 3'UTR上的let-7-5p靶位点在昆虫中保守。分别克隆了家蚕和小菜蛾Chinmo和Imp的3'UTR,通过双荧光素酶报告系统转染239T细胞证实了let-7-5p对Chinmo和Imp两个基因的调控作用。【结论】发现在4个昆虫精巢干细胞自我更新相关基因Zfh-1,Chinmo,Ken和Imp的3'UTR上存在大量的miRNA靶标位点。其中Chinmo及Imp基因3'UTR上let-7-5p靶位点在大多数全变态昆虫中保守,双荧光素酶报告系统实验证实了家蚕和小菜蛾中let-7-5p与Chinmo和Imp存在相互作用,为进一步研究miRNA在昆虫精子发生进程中的功能提供了参考。

摘要: 【目的】分析昆虫的线粒体基因组能很好地指示昆虫物种的亲缘关系。本研究旨在探索琥珀蚕Antheraea assama线粒体基因组并在线粒体水平上了解大蚕蛾科(Saturniidae)属及种间的分子系统进化关系。【方法】采用PCR步移法并结合克隆测序的策略,测定了珍稀绢丝昆虫琥珀蚕的线粒体基因组全序列,分析其结构特点和碱基组成;采用邻近距离法(NJ)构建大蚕蛾科及外群共14种昆虫线粒体蛋白质编码基因的系统发育树,并分析琥珀蚕在大蚕蛾科中的系统发育关系。【结果】琥珀蚕线粒体基因组序列全长15 312 bp(Gen Bank登录号:KU301792),包含13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因、2个核糖体rRNA基因和一段332 bp的A+T富集区,呈现典型的鳞翅目昆虫线粒体基因组的核苷酸组成及基因排布顺序。分析结果表明,琥珀蚕线粒体基因组中A+T含量高达80.18%,13个蛋白质编码基因中,除了COX1以CGA为起始密码子,其他均为典型的起始密码子ATN。COX1、COX2和ND5均以不完整的T为终止密码子,其余基因都是以典型的TAA或TAG为终止密码子。预测的22个tRNA二级结构中,除tRNASer(AGN)缺乏DHU臂外,其他21个tRNA均能形成典型的三叶草结构。由线粒体蛋白质基因串联序列构建的NJ系统发育树表明,琥珀蚕与柞蚕Antheraea pernyi、天蚕Antheraea yamamai、明目大蚕Antheraea frithi构成鳞翅目大蚕蛾科柞蚕属Antheraea这一分支。在9种大蚕蛾科昆虫中,琥珀蚕与柞蚕属的天蚕亲缘关系最近,与巨大蚕蛾属Attacus的乌桕大蚕Attacus atlas亲缘关系较远。【结论】琥珀蚕线粒体基因组的基因排列方式同其他已测定的鳞翅目昆虫的完全相同。基于线粒体基因组的大蚕蛾科昆虫系统发育关系与传统的形态分类学结果一致,即琥珀蚕隶属于柞蚕属Antheraea。

摘要: 【目的】Sox家族是一类转录调控因子,在多细胞动物的发育过程中起到了极其重要的作用。本研究旨在获得家蚕Bombyx mori Sox家族基因,并分析其在幼虫不同组织和发育阶段的表达模式及功能。【方法】采用cDNA末端快速扩增方法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆家蚕Sox家族基因,并对其序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体,诱导原核表达并得到其蛋白的多克隆抗体,并以Western blot验证其蛋白在家蚕胚胎发育时期(产卵后24,48,72,96,120,144,168,192和216 h)和蚁蚕的表达特征。同时,使用半定量RT-PCR技术分析这一基因在家蚕整个发育过程以及5龄第3天幼虫不同组织(精巢、卵巢、神经节、头部、丝腺、脂肪体、马氏管、中肠、后肠、表皮、血液、气管)中的表达谱。【结果】克隆获得一个家蚕Sox家族基因,将其命名为BmDichaete(Gen Bank登录号:KY914554),其cDNA序列全长为1 541 bp,开放阅读框长741 bp,编码246个氨基酸,预测分子量大小为27.3 kD,等电点为9.89。同源序列比对和系统进化分析显示,BmDichaete具有Sox家族的典型HMG结构域,并与其他鳞翅目昆虫的Dichaete蛋白具有较高的同源性。对其表达模式分析发现,BmDichaete在家蚕整个发育时期都有表达,从胚胎发育后期到蛹前期持续高表达,在蛹后期及成虫期表达量有所下降,并且该基因在家蚕5龄第3天幼虫的卵巢、头部、丝腺及后肠组织中显著高表达。Western blot分析结果显示,BmDichaete在家蚕胚胎发育过程中持续而稳定地表达。【结论】家蚕BmDichaete具有典型HMG结构域,属于Sox家族成员。BmDichaete在家蚕胚胎发育的各个时期都发挥作用。本研究为进一步探索该基因在家蚕中的功能奠定了基础。