摘要: 【目的】利用计算机模拟技术,对冈比亚按蚊Anopheles gambiae犬尿氨酸甲酰胺酶(kynurenine formamidase,KFase)的潜在抑制剂进行虚拟筛选,以获得可以削弱冈比亚按蚊作为中间宿主传播疟疾等蚊媒疾病的候选杀蚊剂。【方法】下载冈比亚按蚊KFase的氨基酸序列,通过BLAST方法查询不同物种中的同源蛋白质,并利用MEGA6最大似然法(maximum likelihood method)构建进化树,选择适于作为模板的同源蛋白黑腹果蝇Drosophila melanogaster KFase晶体结构(PDB ID:4E14),对冈比亚按蚊KFase进行三维建模。利用随机森林算法对小分子化合物数据库进行筛选,并对筛选结果进行处理,模拟自然条件下有机小分子与冈比亚按蚊KFase的结合以及分子对接,从而筛选出冈比亚按蚊KFase的潜在抑制剂。【结果】获得3个小分子化合物与冈比亚按蚊KFase结合的亲和能较低,分别是:N-(2,4-diketo-1H-pyrimidin-6-yl)-2-fluoro-benzamide;3-(4-fluorophenyl)-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylic acid;N-(2-oxo-2,3-dihydro-1Himidazo[4,5-b]pyridin-5-yl)-succinamic acid。它们与冈比亚按蚊KFase结合的亲和能分别为:-9.0,-8.7和-8.9 kcal/mol。【结论】N-(2,4-diketo-1H-pyrimidin-6-yl)-2-fluoro-benzamide,N-(2-oxo-2,3-dihydro-1H-imidazo[4,5-b]pyridin-5-yl)-succinamic acid和3-(4-fluorophenyl)-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylic acid是冈比亚按蚊犬尿氨酸甲酰胺酶的潜在竞争性抑制剂,这些化合物是否可作为杀蚊剂的候选化合物有待实验验证。

摘要: 【目的】以致倦库蚊Culex pipiens quinquefasciatus初孵幼虫组织为材料建立细胞系并对其进行分子鉴定。【方法】将实验室筛选的对硫磷抗性的致倦库蚊深桂品系的初孵幼虫剪碎后放入添加20%胎牛血清的改良M199培养基原代培养,并对原代细胞用胰蛋白酶传代培养成细胞系;通过显微镜观察其生物学特性以及DNA扩增指纹图谱和内转录间隔区序列鉴定其组织来源。【结果】该细胞系Cxq-1在M199完全培养基中生长良好,已成功传代培养12个月,并于液氮中冻存,并多次成功复苏。通过DNA扩增指纹图谱鉴定,Cxq-1与实验室培养的其他昆虫细胞DNA指纹图谱的条带各异,表明确为同源昆虫致倦库蚊细胞系。通过内转录间隔区序列测定技术鉴定,Cxq-1的r DNA-ITS1和r DNA-ITS2序列与Gen Bank中致倦库蚊相应核酸序列的一致性大于99%,表明其来源组织确为致倦库蚊。【结论】新建立的蚊初孵幼虫细胞系Cxq-1确为致倦库蚊细胞系。该细胞系为实验室今后开展杀虫剂抗性分子机制、蚊媒病毒、寄生虫等研究提供了重要平台。

摘要: 蚊科昆虫是最重要的医学昆虫类群,是人类最致命的动物杀手。准确的蚊虫分类鉴定是媒介蚊虫基础研究和控制的基础。蚊科现代分类学研究起自于林奈1758年对库蚊属Culex种类的记述,200多年来,已定名的种类日渐增多,分类系统已基本成形。本文在系统地编制了蚊科昆虫的世界名录和地理分布记录的基础上,概述了世界范围内蚊科昆虫的分类研究历史,属级及以上类群的分类系统、种类及其生物学研究现状,并作了初步讨论和展望。目前,全球已知蚊虫41属201亚属3 573种,其中我国已知20属63亚属419种。按蚊亚科(Anophelinae)被认为是蚊科内单系类群,包括按蚊属Anopheles、白蚊属Bironella和沙蚊属Chagasia 3属11亚属489种。其中,按蚊属已知476种,占按蚊亚科已知种97%,是疟疾的单一传播媒介。库蚊亚科(Culicinae)被认为是一个复系类群,共计11族38属190亚属3 084种,系统发育关系尚未解决。伊蚊族(Aedini)、库蚊族(Culicini)、煞蚊族(Sabethini)和蓝带蚊族(Uranotaeniini)是其中的较大族,分别拥有1 262,800,432和270种。特别是库蚊属Culex、伊蚊属Aedes和曼蚊属Mansonia的许多种类是非常重要的医学媒介昆虫。在所有这些蚊虫种中,东洋区的种类最多,达1 075种;其次为新热带区(951种),非洲区(798种),澳洲区(542种),古北区(251种);新北区分布种类最少,有196种,不少种类跨区分布。这些信息有助于对世界范围内蚊科昆虫分类和分布现状的整体了解。由于隐存种(cryptic species)广泛存在,实际种数应是已定名种数的35倍。蚊科昆虫的系统分类对于蚊科昆虫的准确鉴定、基础生物学及蚊媒病传播机制研究、媒介蚊虫及蚊媒病控制都具有非常重要的理论和应用价值,蚊科昆虫的分类、系统发育和区系仍是急需要研究的重要课题。

摘要: 【目的】研究中华按蚊Anopheles sinensis气味结合蛋白1(Asin OBP1)与避蚊胺(N,N-diethylm-toluamide,DEET)的结合特性,并与埃及伊蚊Aedes aegypti Aaeg OBP1、致倦库蚊Culex quinquefasciatus Cqui OBP1进行比较,分析与DEET互作的关键氨基酸残基。【方法】利用原核表达载体进行目的蛋白Asin OBP1的原核表达及纯化。以N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)作为荧光探针,通过荧光竞争结合实验对Asin OBP1与DEET的结合特性进行分析,并比较Asin OBP1,Aaeg OBP1和Cqui OBP1与DEET的结合能力,通过分子对接鉴定其与DEET互作的氨基酸残基。【结果】Asin OBP1能与DEET结合,解离常数为29.55μmol/L。在相同实验条件下,Cqui OBP1和Aaeg OBP1都能结合DEET,解离常数分别为17.15和12.81μmol/L。与Aaeg OBP1和Cqui OBP1相比,Asin OBP1结合DEET的能力最弱,Aaeg OBP1最强。分子对接显示,DEET分子结合在Asin OBP1二聚体靠近交界面的结合口袋边缘,结合口袋由α4,α5和α6上的氨基酸残基Leu-92,Leu-95,His-96,Leu-99,Ala-107,Met-108,Met-110,Gly-110,Cys-114,Leu-115,Trp-133,Met-108',Lys-112'和Leu-115'组成。比较分析发现3个蛋白中与DEET甲苯基团形成疏水性作用的氨基酸残基、与DEET羰基氧形成氢键的氨基酸残基是相同的,但与DEET二乙基侧链形成疏水性作用的氨基酸残基中,有一个位置存在差异,Aaeg OBP1是Leu,而Asin OBP1和Cqui OBP1是Met残基。Leu的疏水性强于Met,可能是Aaeg OBP1与DEET的结合能力较强的原因之一。【结论】Asin OBP1能够结合DEET,不同蚊虫气味结合蛋白1与DEET的亲和力存在差异,进一步探索这些差异形成的原因对于阐明气味结合蛋白与DEET互作的模式具有重要的参考价值。

摘要: 【目的】对中华按蚊Anopheles sinensis谷胱甘肽-S-转移酶E6(As GSTE6)进行初步晶体学研究,为深入研究其空间结构奠定基础。【方法】利用生物信息学软件,首先对中华按蚊As GSTE6进行生物信息学预测和分析;然后进行分子克隆,构建重组子p ET28a-As GSTe6;利用大肠杆菌Escherichia coli原核表达系统进行诱导表达;采用Ni-NTA金属螯合层析和葡聚糖凝胶层析的方法对重组蛋白进行纯化;通过葡聚糖凝胶层析和化学交联的结果分析蛋白的聚合状态;运用坐滴蒸气扩散法对重组蛋白进行结晶筛选。【结果】生物信息学分析结果表明,As GSTE6分子量为25.28 k D,无信号肽和跨膜区,是亲水性蛋白;三级结构预测结果显示,As GSTE6主要由一个小的βαβαββα折叠模式的N端结构域和一个大的全螺旋的C端结构域组成。多重序列比对结果表明,在不同昆虫中GSTE6具有高度保守性。分子克隆得到中华按蚊As GSTE6的编码基因As GSTe6序列,大小为672 bp。在大肠杆菌中As GSTE6主要在上清中有大量表达,为可溶性表达;通过镍柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化出了高纯度且稳定的As GSTE6重组蛋白;凝胶过滤层析结合化学交联的结果证实体外纯化的融合蛋白As GSTE6主要呈二聚体状态;通过晶体筛选获得了As GSTE6的晶体。【结论】运用结晶学的方法获得了As GSTE6的晶体,这为后续解析As GSTE6的三维结构奠定了基础。