摘要: 【目的】探讨野生环境下不同地区中华按蚊Anopheles sinensis共生微生物群落与杀虫剂抗性的关系。【方法】采集分别来自中国重庆、云南和安徽野生中华按蚊雌成虫，采用WHO标准体外生物测定法和0.05%拟除虫菊酯类试验纸，对中华按蚊雌成虫进行拟除虫菊酯类药敏试验，获得杀虫剂敏感(FS)和杀虫剂抗性(FR)的中华按蚊雌成虫并通过Illumina Hiseq 2000平台进行全基因组高通量测序，比对16S rRNA和18S rRNA基因序列鉴定杀虫剂敏感和杀虫剂抗性中华按蚊共生微生物，并进行α多样性分析、β多样性分析、聚类分析、主坐标分析(principal coordinates analysis, PCoA)和共生微生物群落差异分析。【结果】从来自重庆、云南和安徽FS和FR野生中华按蚊雌成虫中鉴定到共生微生物3 284种，分属14门52属。安徽FR野生中华按蚊雌成虫共生微生物多样性差异及群落丰富度最高，重庆FS野生中华按蚊雌成虫的最低。野生中华按蚊雌成虫共生微生物群落首先按地区聚类，其中重庆和云南野生中华按蚊共生微生物群落多样性更相似。FR野生中华按蚊雌成虫共生微生物中10株细菌丰富度更高，包括2株蓝细菌属Cyanobacteria细菌、3株盐杆菌目(Halobacteria)细菌、1株赭黄嗜盐囊菌属Haliangium细菌、3株瘤胃菌科(Ruminococcaceae)细菌和1株链球菌属Streptococcus细菌。【结论】野生中华按蚊共生微生物群落具有地区差异性和抗性差异性，鉴定到的共生微生物对于中华按蚊杀虫剂抗性可能起到积极作用，研究结果为揭示中华按蚊杀虫剂抗性提供思路。

摘要: 【目的】为了研究致倦库蚊Culex quinquefasciatus成蚊吸食血餐及感染乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)前后的中肠细菌多样性及差异，更深层次地揭示致倦库蚊与其中肠细菌之间的关系，以及血液消化和病毒感染期间中肠细菌发生变化的原因。【方法】提取吸食糖水(10%蔗糖溶液)、不含JEV血餐和含JEV血餐的致倦库蚊成蚊中肠细菌基因组DNA,PCR扩增中肠细菌的16S rDNA高变区序列，采用Illumina NovaSeq6000测序平台进行测序并进行生物信息学分析；提取吸食不含JEV血餐和含JEV血餐的致倦库蚊成蚊中肠总RNA,使用RT-qPCR检测中肠中抗菌肽(antimicrobial peptide, AMP)基因CqAttacin,CqCecropin,CqCecropin A,CqDefensin A和CqDefensin C表达量。【结果】致倦库蚊成蚊吸食血餐前后的中肠细菌共有204个扩增子序列变体(amplicon sequence variants, ASVs),归属于4门9纲17目27科36属；感染JEV前后的致倦库蚊中肠细菌共有120个ASVs,归属于6门13纲23目38科47属。在属水平上，伊丽莎白金菌属Elizabethkingia作为优势菌属普遍存在于各中肠细菌中；肠杆菌属Enterobacter在吸食血餐后第2天时的致倦库蚊成蚊中肠中丰度最高，摩根氏菌属Morganella、根瘤菌属Rhizobium和鲍特氏菌属Bordetella则主要存在于感染了JEV的致倦库蚊成蚊中肠内。吸食糖水与吸食血餐后第2天时的致倦库蚊成蚊中肠细菌代谢通路差异最大，主要差异代谢通路是磷酸转移酶系统、铁载体类非核糖体肽的生物合成、N-聚糖生物合成、脂肪酸生物合成以及一些氨基酸的代谢通路。感染与未感染JEV的致倦库蚊成蚊中肠菌群存在差异，且感染JEV后中肠细菌丰富度更高。吸食血餐使致倦库蚊成蚊中肠中抗菌肽基因CqAttacin,CqCecropin,CqDefensin A,CqDefensin A和CqDefensin C表达量与吸食糖水的对照组的相比上调，而感染JEV使抗菌肽基因CqCecropin A,CqDefensin A和CqDefensin C表达量与吸食不含JEV血餐的相比显著下调。【结论】致倦库蚊成蚊吸食血餐和感染JEV均导致中肠细菌发生变化，前者表明血液消化过程对中肠细菌具有选择性，后者则可能与JEV感染导致的致倦库蚊成蚊中肠抗菌肽基因表达量下调有关。

摘要: 【目的】研究中华按蚊Anopheles sinensis细胞色素P450基因AsCYP9J5是否与溴氰菊酯抗性有关。【方法】PCR克隆中华按蚊AsCYP9J5的开放阅读框并进行生物信息学分析。采用RT-qPCR检测AsCYP9J5在中华按蚊溴氰菊酯敏感品系(WX-LS)和抗性品系(YN-LR和CQ-LR)雌蛹和雌成蚊以及WX-LS雌蛹头、胸、腹部前3节(腹部前端)、腹部剩余部分(腹部后端)和25 mg/mL溴氰菊酯诱导体外培养的雌蛹头中的表达量。基于上述AsCYP9J5表达量，于YN-LR和CQ-LR化蛹后20 h时雌蛹头部注射dsAsCYP9J5和dsEGFP进行RNAi,采用RT-qPCR检测成蚊中AsCYP9J5的表达量，统计溴氰菊酯处理后成蚊半数击倒时间(half knockdown time, KT_(50))、击倒率和死亡率。通过分子对接模拟预测AsCYP9J5与溴氰菊酯相互作用的氨基酸残基。【结果】克隆获得AsCYP9J5开放阅读框，全长1 626 bp,编码541个氨基酸，无信号肽和跨膜结构域。AsCYP9J5在YN-LR和CQ-LR不同发育阶段表达量不同，化蛹末期至羽化后9 h在YN-LR中的表达量显著高于在WX-LS中的，在化蛹后30 h至羽化后72 h期间CQ-LR中高表达，各发育阶段(化蛹后20 h除外) CQ-LR中的表达量均显著高于在WX-LS中的；AsCYP9J5在WX-LS雌蛹头部的表达量最高，其次是在胸部，而在腹部前端和腹部后端的表达量接近并最低。溴氰菊酯诱导12 h时WX-LS雌蛹头部AsCYP9J5的表达量比对照组上调了11倍，诱导24 h时AsCYP9J5的表达量略低于对照组。与注射dsEGFP的对照组相比，注射dsAsCYP9J5的YN-LR和CQ-LR处理组成蚊AsCYP9J5的表达量分别下调了约68%和38%,分别约提前10和20 min出现明显的击倒现象，击倒率明显升高，死亡率分别增加了28.6%和24.0%,表明沉默AsCYP9J5导致中华按蚊对溴氰菊酯的敏感度显著增加。分子对接模拟结果显示，溴氰菊酯可以进入AsCYP9J5的结合口袋，并且与Arg-488形成二元的Pi-阳离子相互作用，与AsCYP9J5的Phe-109发生稳定的T型Pi-Pi叠合，与Cys-348和Thr-344形成Pi-硫与Pi-孤对电子相互作用，侧链可以与AsCYP9J5的Gln-224形成稳定氢键相互作用，也可以与Ile-227,Leu-413和Lys-53形成稳定的疏水相互作用网络。【结论】本研究结果表明AsCYP9J5参与中华按蚊溴氰菊酯抗性表型的维持，这为进一步探究该基因编码的蛋白酶代谢溴氰菊酯的分子机理奠定了前期基础。

摘要: 【目的】利用P2C可以定向进入卵巢以及Gal4蛋白可与UAS序列稳定结合的特点，在中华按蚊Anopheles sinensis中建立高效的非胚胎期外源DNA投递技术系统。【方法】注射P2C-Gal4-DsRed重组蛋白至吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部，通过冰冻切片荧光观察和Western blot检测分析重组蛋白P2C-Gal4-DsRed在卵巢中的投递效率；制备P2C-Gal4 DNA BINDING重组蛋白，构建包含12×UAS重复基序的转基因质粒和辅助质粒，通过电泳迁移实验分析重组蛋白P2C-Gal4 DNA BINDING和12×UAS重复基序间的体外结合；分别将体外孵育的P2C-Gal4 DNA BINDING+辅助质粒ITF36-12×UAS和P2C-Gal4 DNA BINDING+转基因质粒ITF2-12×UAS afm复合物注射入吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部，于血餐后40 h时提取其卵巢组织DNA,并通过特异性引物PCR扩增和测序分析外源DNA在活体中的投递情况。【结果】100%注射P2C-Gal4-DsRed的中华按蚊雌成蚊卵巢在绿色滤光片下呈现明显的红色荧光，表明P2C-Gal4-DsRed重组蛋白能够被高效地导入雌成蚊卵巢中；P2C-Gal4 DNA BINDING重组蛋白能够与12×UAS重复基序以及含有该重复基序片段的质粒稳定结合；分别有91%和93%的注射了P2C-Gal4 DNA BINDING+ITF36-12×UAS和P2C-Gal4 DNA BINDING+ITF2-12×UAS afm的雌成蚊卵巢组织中能够检测到外源DNA片段。【结论】在中华按蚊中成功建立了基于P2C卵巢导向肽和Gal4-12×UAS重复基序结合特性的外源DNA投递技术体系；通过此技术平台能够便捷、快速和高效地实现质粒等DNA分子在中华按蚊卵巢中的投递，这为进一步简化转基因、过表达及基因敲入等遗传操作奠定了基础。

摘要: 【目的】探究白纹伊蚊Aedes albopictus烟碱型乙酰胆碱受体α5(nicotinic acetylcholine receptor α5, nAChR-α5)亚基是否是双氧木脂素A(haedoxan A, HA)潜在的作用靶标，为白纹伊蚊的有效防治提供参考。【方法】利用PCR克隆白纹伊蚊nAChR-α5编码区(coding sequence, CDS)序列并构建系统发育树；利用RT-qPCR检测白纹伊蚊nAChR-α5在不同发育阶段(1-4龄幼虫、蛹和未吸血的雌成蚊)的表达量；利用壳聚糖/dsRNA纳米颗粒介导RNAi技术敲减白纹伊蚊2龄幼虫nAChR-α5的表达量；生物测定RNAi后的白纹伊蚊3龄幼虫对HA[LC_(30)(0.3 mg/L)和LC_(50)(0.4 mg/L)]的敏感性。【结果】白纹伊蚊nAChR-α5的CDS长1 296 bp,编码431个氨基酸，具有nAChR的典型半胱氨酸环(Cys-loop)。蛋白序列比对和系统发育树表明白纹伊蚊nAChR-α5与埃及伊蚊A.aegypti的nAChR-α5同源性最高，亲缘关系最近。nAChR-α5在白纹伊蚊4龄幼虫中的表达量最高，其次是在雌成虫中的；饲喂壳聚糖/dsnAChR-α5纳米颗粒(dsRNA浓度为0.3%w/w)后24 h时对白纹伊蚊2龄幼虫nAChR-α5的干扰效率最高，达到70%。生测结果表明，与饲喂不含dsRNA饲料的空白对照和饲喂含有壳聚糖/dsGFP纳米颗粒饲料的阴性对照相比，在LC_(30)和LC_(50)的HA处理下，敲减nAChR-α5组的白纹伊蚊3龄幼虫死亡率显著下降9.89%15.45%,表明敲减nAChR-α5使白纹伊蚊对HA的敏感性显著降低。【结论】白纹伊蚊nAChR-α5可能是HA潜在的作用靶标之一，HA可能通过干扰白纹伊蚊nAChR-α5的功能进而影响神经兴奋传导。