摘要: 【目的】克隆中华按蚊Anopheles sinensis气味结合蛋白2(odorant binding protein 2, OBP2)基因AsinOBP2,分析该基因的表达及其重组蛋白与人体气味物质的结合能力。【方法】采用RT-PCR和RACE技术克隆AsinOBP2的全长cDNA序列,通过qPCR分析AsinOBP2基因在中华按蚊不同发育时期(雌雄蛹及羽化后第0, 1, 2, 3, 6和9天的成虫)、3日龄成虫不同嗅觉组织(触角、喙和下颚须)和吸血前后3日龄雌成虫中的表达水平;通过原核表达和亲和层析,表达并纯化AsinOBP2重组蛋白,运用荧光竞争结合实验测定重组蛋白AsinOBP2与39种人体气味物质的结合能力。【结果】克隆并测序了AsinOBP2的全长cDNA序列(GenBank登录号:MT700441),其开放阅读框长492 bp,编码163个氨基酸,N末端30个氨基酸为信号肽序列,具有气味结合蛋白典型的6个保守半胱氨酸结合位点,属于Classic亚家族成员。qPCR结果显示,AsinOBP2在中华按蚊羽化后的表达水平逐渐增强,羽化后第6天表达水平最高,随后开始下降;AsinOBP2主要在雌成蚊触角中表达;吸食血液后3日龄雌成虫中AsinOBP2的表达水平显著下降。荧光竞争结合实验显示,在测定的39种人体气味物质中,重组蛋白AsinOBP2与12种化合物具有结合活性,其中与吲哚结合能力较强,解离常数Ki=27.15μmol/L,其次是与正丙胺、2-甲基丁醛和葵醛,解离常数Ki分别为42.49, 48.33和47.90μmol/L。【结论】根据AsinOBP2基因的表达特点及其重组蛋白与人体气味物质的结合能力,后者表明AsinOBP2对人体气味物质具有明显的选择结合特性,我们推断AsinOBP2在雌蚊追寻宿主的行为中起着重要的作用。

摘要: 【目的】利用权重基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)探索埃及伊蚊Aedes aegypti不同组织基因共表达模式。【方法】从NCBI SRA数据库中选择埃及伊蚊不同组织的转录组数据中具代表性的9种组织(雌雄成蚊的触角和脑,雌蚊的喙、下颚须和卵巢,雄成蚊的前足、中足、后足和腹部末端)的双端测序数据;经过缺失值移除以及方差计算后,筛选出方差最大的5 000个基因,利用R软件中WGCNA包建立埃及伊蚊成蚊不同组织的基因共表达网络并划分模块;然后利用clusterProfiler包对组织特异性模块内的基因进行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析,并用Cytoscape软件中的CytoHubba插件筛选共表达模块内的hub基因。【结果】从埃及伊蚊成蚊不同组织中共鉴定出11个基因共表达模块,在雌蚊触角、喙、卵巢、下颚须以及雄蚊脑、腹部末端组织中各鉴定出1个特异性表达模块,雄蚊前足、中足和后足组织中无特异性表达模块。6个组织特异性表达模块内基因功能注释到组织生物学功能;其中,雌蚊触角特异性green模块内基因具有气味结合和嗅觉受体活性等功能;雌蚊喙特异性purple模块内基因具有丝氨酸型肽链内切酶活性和丝氨酸水解酶活性等功能;雄蚊脑特异性blue模块内基因在生物学过程调节、信号转导和神经系统过程等生物学过程中发挥主要作用。利用CytoHubba进一步鉴定出所选组织特异性共表达模块中具有高连通性的hub基因,包括AAEL010426,AAEL002896,AAEL002600,AAEL000961,AAEL007784和AAEL006429。【结论】本研究依据埃及伊蚊不同组织转录组数据,利用WGCNA方法发现了许多重要的基因共表达模块。本研究的结果为蚊虫基因共表达模式分析提供新思路和方法基础,对探究蚊虫不同组织特有的基因资源信息以及功能基因生物信息学研究有参考价值。

摘要: 【目的】探究细胞色素P450基因AsCYP6Z2是否与中华按蚊Anopheles sinensis抗拟除虫菊酯有关。【方法】克隆中华按蚊AsCYP6Z2基因的编码区。采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)检测该基因在中华按蚊溴氰菊酯敏感品系(WX-LS)和抗性品系(YN-LR)雌蚊不同发育阶段的表达和在敏感品系雌蛹不同组织中的表达。雌蛹腹部后端分别在25 mg/mL溴氰菊酯溶液和纯丙酮溶液(对照)中体外培养后,采用qPCR检测AsCYP6Z2在溴氰菊酯处理组和丙酮对照组中的表达差异。于化蛹后10 h分别注射dsAsCYP6Z2(RNAi组)和dsEGFP(对照组),采用qPCR检测AsCYP6Z2在RNAi组和对照组中的表达差异;采用生物测定方法测定RNAi组和对照组中雌成蚊接触0.05%溴氰菊酯药膜1 h内的击倒率及雌成蚊接触0.05%溴氰菊酯药膜1 h并恢复24 h时的死亡率。通过分子对接预测该基因与溴氰菊酯相互作用的氨基酸残基。【结果】克隆获得了AsCYP6Z2基因(GenBank登录号:MT840336)的编码区,其开放阅读框(ORF)长1 251 bp,编码416个氨基酸,无信号肽和跨膜结构域。发育表达谱表明,AsCYP6Z2基因主要在化蛹30 h至成蚊3 h期间高表达,且抗性品系的基因表达量明显高于敏感品系的;组织表达谱显示该基因在腹部后端的表达量较高,其次是在腹部前端和胸部,在头部的表达量最低。雌蛹腹部后端在25 mg/mL溴氰菊酯溶液中培养12 h和24 h后,处理组中AsCYP6Z2的表达量相比于对照组(纯丙酮培养组)分别上调4倍和13倍。RNAi干扰AsCYP6Z2后,RNAi组中AsCYP6Z2基因的表达量相较于对照组(dsEGFP注射组)下调了约80%。雌成蚊接触0.05%溴氰菊酯药膜1 h后,RNAi组中的个体比对照组中的约提前20 min出现明显的击倒现象,且击倒率明显高于对照组;雌成蚊接触0.05%溴氰菊酯药膜1 h并恢复24 h后,RNAi组中的个体死亡率相比对照组增加了17%,表明沉默AsCYP6Z2基因导致蚊虫对溴氰菊酯的敏感度显著增加。溴氰菊酯与AsCYP6Z2预测蛋白的分子对接研究结果显示,溴氰菊酯可以进入AsCYP6Z2蛋白的结合口袋,并且与Cys-155形成Pi-硫相互作用以及产生较稳定的氢键,侧链也可与AsCYP6Z2的Ala-165, Val-72, Leu-76, Leu-82和Ala-24等氨基酸残基形成稳定的疏水相互作用网络。【结论】研究结果表明AsCYP6Z2基因参与中华按蚊溴氰菊酯抗性表型的维持,这为进一步探究该基因在拟除虫菊酯类杀虫剂代谢过程中的分子机理奠定了前期基础。

摘要: 【目的】本研究旨在明确访花昆虫红腹毛蚊Bibio rufiventris触角感器的类型和分布。【方法】通过扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)观察红腹毛蚊雌、雄成虫触角感器的种类、数量和形态,比较雌雄个体间的差异。【结果】红腹毛蚊雌、雄成虫触角均包含3部分,分别为柄节、梗节和鞭节,其中鞭节由8个亚节组成。雌成虫触角平均总长度为862.556±78.662μm,雄成虫触角平均总长度为880.361±83.253μm,雌、雄成虫触角各亚节的长度几乎相似,只有鞭节第8亚节长度有显著差异。红腹毛蚊的触角感器共有4大类,即刺形感器、锥形感器、毛形感器和B?hm氏鬃毛。其中,雌性红腹毛蚊触角感器共有6种亚型,即刺形感器、毛形感器2型、锥形感器(1, 2和4型)和B?hm氏鬃毛;雄性红腹毛蚊触角感器共有5种亚型,即刺形感器、毛形感器1型、锥形感器(2和3型)和B?hm氏鬃毛。【结论】红腹毛蚊雌、雄成虫触角感器在种类、数量以及形态特征方面存在一定差异。本研究为进一步探究红腹毛蚊触角感器的生理功能及其行为活动的分子机制提供了形态学基础。

摘要: 【目的】深入了解镉对白纹伊蚊Aedes albopictus的毒害作用机理和白纹伊蚊对极端环境的适应机制,揭示重金属胁迫对白纹伊蚊种群发生、疾病传播等可能存在的影响,为卫生害虫防控等提供参考依据。【方法】分别用200 mL配制好的50, 100, 200, 300和400 mg/L镉溶液对放置于320 mL一次性杯中长势一致的白纹伊蚊3龄末至4龄初幼虫急性染毒12 h,以双蒸水养殖幼虫作为对照。通过生化方法测定处理后12 h白纹伊蚊幼虫体内海藻糖、葡萄糖和总糖原含量以及可溶性海藻糖酶(TRE1)和膜结合型海藻糖酶(TRE2)活力,并采用qRT-PCR测定这些幼虫体内海藻糖合成酶基因(TPS),TRE1和TRE2表达量。【结果】在200和300 mg/L重金属镉处理12 h时白纹伊蚊幼虫海藻糖含量显著增加,在高镉浓度(300和400 mg/L)处理时葡萄糖含量显著下降,而不同镉浓度急性处理对总糖原含量没有影响。TRE1和TRE2活力在高镉浓度(300和400 mg/L)处理时显著下降。300 mg/L镉处理组TPS相对表达量达到最高值,TRE1和TRE2相对表达量在高镉浓度(300和400 mg/L)处理时显著下降,与酶活力变化趋势表现一致。【结论】当镉浓度低于半致死浓度(217 mg/L)时,镉急性胁迫使白纹伊蚊幼虫TPS基因表达上调,而TRE基因则表达量下降,TRE活力降低,从而促使葡萄糖转化为海藻糖,通过海藻糖的积累来应对镉胁迫压力。这些结果说明海藻糖在白纹伊蚊在重金属应激中起一定作用,白纹伊蚊幼虫可以通过合成海藻糖从而提高应对镉胁迫的抗逆能力。