摘要: 昆虫在低温冷驯化过程中会发生很多基因表达的改变,从转录组层面上开展广泛的研究有助于全面认识昆虫对冷响应的分子机制。为了对荒漠昆虫小胸鳖甲Microdera punctipennis的4℃低温转录组数据中一个上调表达的Attacin基因(MpAttacin1)进行深入了解并分析其对低温诱导的响应情况,本研究通过生物信息学分析对该基因进行了鉴定,并利用实时荧光定量PCR对其在低温下的mRNA水平进行了检测。结果表明:获得的MpAttacin1cDNA长度为523 bp,包含一个456 bp的开放阅读框和67 bp的5'端非翻译区。MpAttacin1编码含有151个氨基酸残基的多肽,N端含有17个氨基酸的信号肽序列。同源性分析表明,其氨基酸序列与其他鳞翅目、双翅目和鞘翅目昆虫的抗菌肽Attacin具有30%40%的一致性。以邻接法(neighbor-joining,NJ)构建的系统进化树表明,小胸鳖甲Attacin1与其他鞘翅目昆虫的Attacin起源于共同的祖先,属于Attacin_C超家族。实时荧光定量PCR分析结果显示,在4℃与-4℃低温胁迫时,MpAttacin1基因的转录都呈现先升高后降低的应激反应趋势,但在对低温的响应时间和强度上有所不同。在4℃处理5 h和9 h后,MpAttacin1的表达量分别为对照组的2.3和3.8倍,而在-4℃处理7 h和9 h后,分别为对照组的2.4和1.5倍。这些研究表明,除已知的抗菌功能外,Attacin在昆虫的低温适应过程中可能也发挥着重要的作用。

摘要: 为了挖掘荒漠昆虫小胸鳖甲Microdera punctipennis的耐寒性相关基因,从其4℃转录组数据库筛选出差异表达的几丁质酶基因片段394seq2,检测其编码蛋白的几丁质酶活性,研究该基因的表达对低温胁迫的响应情况。采用RACE技术扩增394seq2的5′端和3′端,克隆全长序列,将其ORF构建至原核表达载体pET28a,导入Transetta(DE3)感受态细胞,诱导表达融合蛋白,Western blot法检测表达蛋白的正确性;二硝基水杨酸法测定几丁质酶活性,qRT-PCR技术探究低温表达谱。结果表明,394seq2的5′-UTR为39 bp,3′-UTR为181 bp;ORF为1 140 bp。系统进化树显示该序列与赤拟谷盗几丁质酶8(TcCHT8)聚为一支,命名为MpCht8c。MpCht8c编码379个氨基酸,分子量为41.2 kDa,理论等电点pI为4.67。MpCHT8c含有完整的几丁质酶结构基序,其N端含有几丁质酶催化域,内有一个类18家族几丁质酶的保守基序KXXXXXGGW,中部是一段富PEST的连接区,C端是几丁质酶结合域,属于IV型昆虫几丁质酶。Western blot结果表明His-MpCHT8c在大肠杆菌中正确表达;融合蛋白粗酶液的几丁质酶活性为1.89 U/mL。在4℃冷胁迫0.5 h和5-9 h时Mpcht8c出现两个上调表达峰值,约为对照的2倍。研究表明荒漠昆虫小胸鳖甲的几丁质酶MpCHT8c具有几丁质酶活性,MpCht8c基因的表达可快速响应4℃低温胁迫。研究结果有助于深入研究几丁质酶在小胸鳖甲耐寒性方面的作用机理。