摘要: 【目的】本研究旨在通过克隆茶尺蠖Ectropis obliqua解毒相关无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase, PPase)基因EoPPase672,并对其进行原核表达和功能验证，为更好地了解EoPPase672在茶尺蠖解毒过程中的作用及相关功能的应用提供理论依据。【方法】从茶尺蠖转录组数据库中筛选到EoPPase672 cDNA,构建原核表达载体pET-32a-EoPPase672,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),SDS-PAGE及Western blot鉴定重组表达蛋白；测定EoPPase672的浓度以及酶促反应最适温度、最适pH和最适金属离子。利用qRT-PCR检测亚致死浓度(LC_(10)=2.08 mg/L)溴氰菊酯刺激后不同时间不同龄期茶尺蠖幼虫中EoPPase672的表达水平。基于PPase的特性，分析重组蛋白EoPPase672在PCR反应中对焦磷酸盐(PPi)的去除效果和对PCR扩增效率的影响。【结果】通过原核表达和纯化获得重组蛋白EoPPase672。通过无机磷酸盐(Pi)含量标准曲线测得该酶的比活力为1 279.6 U/mg,酶促反应的最适温度为65℃、最适pH为7.5、最适金属离子为Mg(2+)。茶尺蠖幼虫被溴氰菊酯(2.08 mg/L)刺激12 h后，2和3龄幼虫EoPPase672的表达量与对照组的相比显著上调，4龄幼虫EoPPase672的表达量小幅上调；被溴氰菊酯刺激24 h后，2和3龄幼虫EoPPase672的表达量与对照组的相比仍然显著上调，但与刺激12 h的2和3龄幼虫中的相比下调。在PCR反应中添加重组蛋白EoPPase672后，部分PPi被水解，解除了PPi对PCR扩增的抑制作用，对PCR扩增效率起到了增强效果。【结论】这些结果表明，重组蛋白EoPPase672可提高PCR扩增效率，EoPPase672基因可能参与了茶尺蠖的解毒过程。研究结果为进一步研究茶尺蠖EoPPase672的功能提供了依据。

摘要: 【目的】水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一种广泛存在于细胞生物膜系统中的跨膜转运蛋白,它在水分渗透压平衡过程中发挥着重要的作用。本研究旨在前期克隆茶尺蠖Ectropis obliqua Prout水通道蛋白AQP1(EoAQP1)基因全长的基础上,进一步明确该蛋白的细胞器定位,并探析其对细胞形态和增殖的影响。【方法】采用双酶切法构建了绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)载体以及绿色荧光蛋白与EoAQP1的真核融合(EoAQP1-GFP)表达载体。通过荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观测了GFP与EoAQP1-GFP蛋白在黑腹果蝇Drosophila melanogaster胚胎细胞系(S2)中的表达特征。利用溶酶体和高尔基体红色荧光探针明确了EoAQP1蛋白在S2细胞内的细胞器定位。通过流式细胞仪和酶标仪检测了EoAQP1蛋白对S2细胞系细胞的颗粒度、大小和增殖的影响。【结果】成功构建了GFP和EoAQP1-GFP的真核表达载体,将其分别命名为pAc5.1-GFP和pAc5.1-EoAQP1-GFP。荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观测结果表明,荧光蛋白GFP均匀填充于S2细胞内稳定表达。融合蛋白EoAQP1-GFP存在两种表达形式:一种以类似于溶酶体的球形和橄球形结构,围绕细胞核在细胞质中散点表达;另一种以类似于高尔基体的半球状和弓形结构表达于细胞质中。溶酶体和高尔基体红色荧光探针检测结果表明,EoAQP1蛋白在溶酶体内没有表达,但与高尔基体完全重叠。流式细胞仪和酶标仪检测结果表明,过表达EoAQP1蛋白可使S2细胞膨胀增大,细胞颗粒度增强,但对细胞增殖无明显影响。【结论】EoAQP1定位于高尔基体中行使功能,该蛋白能改变细胞形态,但不能促进细胞的生长。

摘要: 【目的】明确茶尺蠖Ectropis obliqua Prout 5龄幼虫脑解剖结构,并分析和构建幼虫脑以及脑内部各神经髓结构的三维结构模型。【方法】采用免疫组织化学方法,利用突触蛋白抗体,染色标记脑内神经突触,定位突触联系密集分布的区域,获得脑内部神经髓的结构。利用激光共聚焦显微镜获取脑扫描图像,然后利用三维图像分析软件AMIRA进行图像分析,构建脑的三维结构模型,并计算脑以及脑内各神经髓结构的体积。【结果】突触蛋白抗体染色显示,茶尺蠖5龄幼虫脑内具有很多神经突触联系密集分布的区域,这些不同区域即为脑的不同神经髓结构。茶尺蠖幼虫脑主要包括前脑、中脑和后脑3个组成部分。其中前脑最大,包括成对的视叶、蕈形体、前脑桥和侧副叶以及不成对的中央体。视叶位于前脑的两侧后端。蕈形体位于脑半球正中间位置。侧副叶在中央体的下前方两侧。中央体在脑的正中心。前脑桥在中央体的上方后侧。除这些形态结构明显的神经髓区域外,前脑还包括大量内部边界不明显的神经髓区域,位于前脑左右两侧以及背侧和腹侧,这些区域被总称为中间脑,占整个脑神经髓的66%。触角叶为中脑的主要组成部分,在脑的下部最前端,为一对球状结构。后脑在脑的腹侧和触角叶下方,即围咽神经索进入脑的入口处。【结论】构建了茶尺蠖5龄幼虫脑以及各神经髓结构三维模型,分析了脑内各个神经髓之间的空间位置关系,明确了各神经髓的体积。茶尺蠖幼虫脑体积小而且结构简单的特征与其幼期视觉、嗅觉等感觉器官不发达、活动能力弱、行为简单的生物学习性相对应。

摘要: 【目的】水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一种广泛存在于哺乳动物、植物和微生物中的跨膜转运蛋白,它在细胞水分运输、离子选择透过性和渗透压平衡等过程中发挥着重要的作用。本研究旨在分析茶尺蠖Ectropis obliqua Prout水通道蛋白AQP1的基因特性,在制备多克隆抗体的基础上了解其亚细胞定位分布。【方法】采用同源克隆方法并结合RACE技术克隆茶尺蠖AQP1的基因全长,通过生物信息学网站和软件分析茶尺蠖AQP1的生物学信息;通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测茶尺蠖AQP1在不同发育阶段和6龄幼虫不同组织中的相对表达量;通过原核表达、镍柱纯化并免疫新西兰兔制备了茶尺蠖AQP1的多克隆抗体;通过荧光显微镜观测了茶尺蠖AQP1在黑腹果蝇Drosophila melanogaster胚胎细胞S2中的定位分布,并利用多克隆抗体进行了Western blot验证。【结果】克隆并鉴定了茶尺蠖AQP1全长,将其命名为Eo AQP1(Gen Bank登录号:KT819587),Eo AQP1 c DNA全长1 826 bp,含有780 bp开放阅读框,编码259个氨基酸。系统进化树和氨基酸序列同源性比对表明,Eo AQP1在鳞翅目昆虫中高度保守。跨膜结构和水分渗透模拟表明,Eo AQP1具有经典的水分渗透模型。qRT-PCR结果表明,Eo AQP1在不同发育时期和6龄幼虫不同组织中均有表达且差异显著。亚细胞定位结果表明,Eo AQP1以圆形颗粒状成群聚集于细胞膜周边,而在细胞膜、核膜和细胞质等处均不表达。多克隆抗体Western blot检测结果表明,Eo AQP1多克隆抗体特异性较好,可用于后续相关实验。【结论】获得了Eo AQP1的c DNA序列,明确了Eo AQP1的生物学特征,阐明了Eo AQP1的时空表达特性,成功制备了Eo AQP1多克隆抗体,初步了解了Eo AQP1的亚细胞定位,为进一步研究Eo AQP1的水分渗透机理奠定了分子基础。

摘要: 【目的】蜕皮激素受体(ecdysteroid receptor,EcR)是一种超家族核受体,它能与超气门蛋白USP组成异源二聚体复合物EcR/USP,调节20-羟基蜕皮酮(20E)的生物活性,进而调控昆虫的发育、变态及繁殖等生命过程。本研究旨在克隆茶尺蠖Ectropis obliqua Prout EcR基因全长,并了解该基因的编码蛋白特征和时空表达模式。【方法】通过RT-PCR方法并结合RACE技术,克隆茶尺蠖EcR的基因全长,通过生物信息学软件和在线网站分析茶尺蠖EcR的生物学特性,通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)技术比较茶尺蠖EcR在不同发育时期和6龄幼虫不同组织中的相对表达含量。【结果】克隆并鉴定了茶尺蠖EcR基因,将其命名为Eo-EcR(基因登录号:KP869130.1),Eo-EcR全长2 268 bp,含有1 728 bp开放阅读框,编码576个氨基酸。系统进化树和氨基酸同源性比对表明,Eo-EcR具有相对保守的进化特性,特别是与鳞翅目昆虫的保守性最高。三级结构模拟和功能结构域预测表明,Eo-EcR具有3个经典的结构模型,并以α螺旋为主,功能位点单一且为C4型锌指结构。qRT-PCR结果表明,Eo-EcR在5龄和6龄幼虫期以及成虫期表达量较高,在其他龄期表达量变化不大;同时在前胸腺表达量最高,在血淋巴表达量最低。【结论】明确了Eo-EcR的核苷酸序列及编码蛋白特征,明确了Eo-EcR的时空表达特性。该研究结果为进一步研究Eo-EcR的分子功能和基于Eo-EcR为靶标杀虫剂的研制奠定分子基础。