摘要: 为了建立美洲大蠊 Periplaneta americana变应原蛋白的质谱鉴定方法, 我们将美洲大蠊粗浸液通过 DEAE-52 离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析等分离步骤得到纯化的74 kD蛋白, 对纯化前后的该74 kD蛋白分别进行SDS-PAGE及凝胶内胰酶酶切, 再经液相色谱-电喷雾-串联质谱 (HPLC-ESI-MS-MS) 在线联机分析, 所得质谱数据进入网站 (http: www.matrixscience. com) 进行Mascot检索比对。通过对两者质谱鉴定结果的比较来评估美洲大蠊天然主要变应原蛋白的纯化效果。结果表明, 纯化蛋白经HPLC-ESI-MS-MS鉴定是美洲大蠊主要变应原蛋白; 离子交换层析等纯化步骤可以去除同一分子量的杂蛋白 (如卵黄原蛋白), 从而获得较好的鉴定结果。我们首次成功地运用质谱建立起变应原蛋白的新鉴定方法。

摘要: 以阳性噬菌体克隆为模板 ,通过PCR扩增出目的基因片段并克隆入T载体 ,经测序证实为美洲大蠊Periplanetaamericana变应原CrPI后 ,将该基因亚克隆入表达载体pGEX 5X 1。美洲大蠊变应原CrPI在大肠杆菌中得到高效表达 ,但主要以包涵体形式存在于沉淀中。目的蛋白溶于 6mol L盐酸胍并经稀释复性后 ,经GlutathioneSepharoseTM 4B亲和层析 ,纯度达 90 %以上。以蟑螂过敏病人血清进行免疫印迹检测 ,结果显示重组变应原具有良好的IgE结合活性。

摘要: 【目的】建立美洲大蠊Periplaneta americana中枢神经系统背侧不成对中间神经元(dorsal unpaired median neurons,DUM neurons)的分离方法和DUM神经元电生理实验模型。【方法】IA型胶原酶法消化美洲大蠊末端腹神经节,机械吹打得到DUM神经元细胞,运用膜片钳技术记录DUM神经元细胞电压门控Na+电流。【结果】分离得到的DUM神经元细胞状态良好,具有DUN神经元典型的梨状形态和表面特征。以膜片钳全细胞方式记录到的Na+电流符合钠通道电流特征。【结论】IA型胶原酶消化得到美洲大蠊DUM神经元细胞的方法可靠,能稳定地记录到Na+电流。本文描述的方法为昆虫神经细胞的电生理机制研究提供一个可用的实验模型。

摘要: 为了解鬼臼毒素对昆虫神经系统的影响,采用胞外记录电生理方法观察了4种鬼臼毒素类似物对美洲大蠊Periplaneta americana中枢神经自发放动作电位的影响。结果显示:在0.1 mmoL/L的浓度下,4种物质对美洲大蠊中枢神经自发放动作电位的作用不同。脱氧鬼臼毒素可完全抑制美洲大蠊中枢神经自发放动作电位的产生,其抑制作用可逆;β-阿朴苦鬼臼毒素对美洲大蠊中枢神经自发放动作电位的作用是先兴奋后抑制;鬼臼毒素对美洲大蠊中枢神经自发放动作电位有抑制作用,其抑制作用不完全;4'-去甲鬼臼毒素对大蠊中枢神经自发放动作电位无影响。结果提示,4种鬼臼毒素类似物对昆虫中枢神经自发放动作电位的影响方式与其结构官能团密切相关。

摘要: 根据原肌球蛋白基因序列设计引物,以我国南方地区美洲大蠊Periplaneta americanaRNA为模板,用RT-PCR方法扩增出852bp的全长编码片段,经序列分析发现该基因与NCBI公布的Per a7有3个核苷酸发生改变。将目的片段克隆到pET24a(+)表达载体中,在大肠杆菌BL21Star获得表达,融合蛋白的分子量约为33kD。利用蟑螂过敏性患者血清对表达产物进行Western blotting检测,出现明显的识别条带,说明表达产物具有IgE结合活性。