摘要: [目的]通过克隆绿盲蝽Apolygus lucorum表皮蛋白(cuticular protein,CP)基因AlCP17、制备其多克隆抗体和分析其时空表达特性,为AlCP17蛋白功能的研究奠定基础,也为进一步解析绿盲蝽表皮发育过程中的信号通路图谱提供依据。[方法]基于前期转录组数据克隆绿盲蝽AlCP17的全长序列并进行生物信息学分析;构建AlCP17原核表达载体pCZN1-AlCP17并进行大肠杆菌Escherichia coli体外表达,利用纯化后的重组蛋白制备AlCP17蛋白多克隆抗体;qRT-PCR检测AlCP17在绿盲蝽不同发育阶段(1-5龄若虫和成虫)和3龄初期若虫不同组织(头、胸、足、中肠、脂肪体和表皮)中的表达谱。[结果]克隆获得绿盲蝽AlCP17全长cDNA(GenBank登录号:OM302231),其开放阅读框长594 bp,编码197个氨基酸,预测分子量为21.69 kD,理论等电点为6.11。编码的蛋白质具有典型的表皮蛋白结构特征,含有节肢动物角质层蛋白几丁质保守结合域(non-cysCBD),即Chitin_bind_4结构域;氨基酸序列比结果对显示,AlCP17的氨基酸序列与半翅目臭虫科(Cimicidae)温带臭虫Cimex lectularius的CPA2B-like的序列一致性最高(76.29%);系统发育进化树显示,CP是一种高度保守的蛋白,与温带臭虫的CPA2B-like和茶翅蝽Halyomorpha halys的CP7-like相似性高。IPTG诱导获得原核表达重组蛋白AlCP17,经纯化后制备的AlCP17多克隆抗体纯化效果较好,可以用于后续实验。AlCP17在绿盲蝽不同发育阶段和3龄初期若虫不同组织中均有表达,在初孵1龄若虫中表达量达到峰值,且在若虫各龄期的末期表达量显著上升;在3龄若虫中肠中表达量最高。[结论]克隆了绿盲蝽AlCP17基因全长,具有昆虫表皮蛋白的典型特征,AlCP17在绿盲蝽体内的表达具有发育阶段特异性和组织特异性。这些结果为今后研究这一蛋白在绿盲蝽表皮发育过程中的生理功能奠定了基础。

摘要: 【目的】本文在前期获得绿盲蝽Apolygus lucorum磷脂酶C基因(Al PLC)的基础上,明晰Al PLC基因在绿盲蝽不同日龄若虫中的表达特征,阐明Al PLC重组蛋白的酶学性质。【方法】qRTPCR法分析1-13日龄绿盲蝽若虫Al PLC的表达量;构建含有Al PLC基因的原核表达载体p Czn1-Al PLC;进一步将该表达载体经IPTG诱导表达和蛋白纯化,获得具有磷脂酶活性的重组蛋白;以pNPPC(P-硝基苯基磷酸胆碱)为底物测定不同温度和不同p H下的重组Al PLC蛋白酶活性,最终确定了其酶活性的最佳p H和最适温度。【结果】Al PLC mRNA在绿盲蝽测定的若虫期持续表达,在4,8,12以及13日龄若虫中表达量相对较高。重组蛋白Al PLC可在大肠杆菌Escherichia coli中表达一个约79 k D的蛋白,12%SDS-PAGE显示该蛋白主要以包涵体形式存在;经过变性,复性获得具有磷脂酶活性的纯化蛋白。在蛋白浓度为0.25 mg/m L条件下,该酶最适温度为57℃(179.54±3.96 nmol/μg·min),最适p H为8.5(374.99±2.84 nmol/μg·min)。【结论】结果表明Al PLC在绿盲蝽若虫中表达具有特异的发育历期特性,获得的重组蛋白在较高温度和碱性环境下有较高磷脂酶活性。本研究结果为后续在蛋白水平上解析Al PLC的功能奠定基础。

摘要: 【目的】克隆绿盲蝽Apolygus lucorum核受体基因E75D全长,明确其表达谱,并获得该基因的重组蛋白及制备其单克隆抗体。【方法】利用RACE法克隆绿盲蝽核受体基因Al E75D全长;qRTPCR法分析绿盲蝽不同日龄成虫(1-16 d)及7日龄雌成虫6种组织(脂肪体、飞行肌、卵巢、马氏管、中肠和表皮)中该基因的mRNA相对表达水平;利用NdeⅠ和XbaⅠ双酶切含有目的基因的p MD18-T载体后进行亚克隆,再利用IPTG诱导的重组质粒进行特异性表达重组蛋白,通过GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析纯化靶蛋白;最后通过小鼠免疫、细胞融合及腹水制备重组蛋白的单克隆抗体,Western blot验证该抗体的特异性。【结果】从绿盲蝽中克隆获得蜕皮激素核受体基因Al E75D(Gen Bank登录号:KX912700),其开放阅读框长1 911 bp,编码636个氨基酸,预测分子量为75.68 k D;该基因编码蛋白具有E75D的典型特征,由A/B域(23 aa)、D域(85 aa)、E域(190aa)和F域(338 aa)组成,但缺失C域;绿盲蝽Al E75D的氨基酸序列与半翅目蝽科的豆荚草盲蝽Lygus hesperus的E75D序列一致性最高(为98%)。Al E75D在整个绿盲蝽成虫期均有表达,在7日龄雌成虫中达到峰值;此外,Al E75D在雌成虫6个供试组织中也均有表达,并在脂肪体及卵巢中高表达。双酶切后的重组克隆载体可成功亚克隆到p Czn1载体上,IPTG可成功诱导p Czn1-Al E75D重组质粒特异性表达一个约75 k D的蛋白。用Ni-NTA琼脂糖树脂凝胶纯化重组蛋白,以纯化的重组蛋白为抗原,获得了一株能稳定传代并分泌抗Al E75D蛋白单克隆抗体的细胞株,该单克隆抗体可与绿盲蝽总蛋白及Al E75D重组蛋白特异性结合。【结论】Al E75D在绿盲蝽体内的表达谱表现出发育阶段特异性和组织特异性;本研究获得的其重组蛋白的单克隆抗体具有高特异性。结果为进一步在蛋白水平上分析该基因的功能奠定基础。

摘要: 【目的】绿盲蝽Apolygus lucorum(Meyer-Dür)是我国Bt棉田内一类重要的刺吸性害虫。有机磷类和菊酯类杀虫剂因其对绿盲蝽具有较高的触杀毒力,是当前Bt棉田内广泛应用的杀虫剂,而新烟碱类杀虫剂因其较低的触杀毒力而没有被推荐使用。但在田间试验中,用新烟碱类杀虫剂处理棉种能够有效减少苗期至开花期绿盲蝽的危害。因此,亟待需要一种准确的毒力测定方法,以重新评价新烟碱类杀虫剂对绿盲蝽的毒力。【方法】本研究在成功研制绿盲蝽人工饲料的基础上,应用瓶膜法和人工饲料混合法两种毒力测定方法测定比较了5类16种杀虫剂对绿盲蝽3龄若虫和成虫的毒力。【结果】应用瓶膜法,新烟碱类杀虫剂对绿盲蝽成虫和若虫的LC_(50)值在337.97496.03μg/mL范围内,显著高于其他类型的杀虫剂(LC_(50)值范围在0.28207.26μg/mL)。然而,应用人工饲料混合法,新烟碱类杀虫剂对绿盲蝽成虫和若虫的LC_(50)值在0.011.08μg/g,与其他类杀虫剂LC_(50)值相等甚至低于其他类杀虫剂。【结论】结果表明新烟碱类杀虫剂对绿盲蝽的胃毒毒力显著强于它的触杀毒力,可用于绿盲蝽的田间防治。推荐人工饲料混合法作为监测绿盲蝽对新烟碱类杀虫剂抗性发展的一个替代方法。

摘要: 【目的】研究葡萄品种的抗性对于绿盲蝽Apolygus lucorum综合防控策略的制定具有重要意义。本研究检测了不同葡萄品种对绿盲蝽的抗性水平,分析了叶片中可溶性蛋白、可溶性糖和叶绿素含量与其对绿盲蝽抗性的关系,以明确不同葡萄品种对绿盲蝽的抗性机理。【方法】以9个葡萄品种(巨峰、玫瑰香、红地球、红宝石、藤稔、赤霞珠、蛇龙珠、霞多丽和品丽珠)为材料,通过连续3年的田间抗性鉴定确定这些葡萄品种对绿盲蝽的抗性水平;分别采用考马斯亮蓝法、蒽酮比色法和乙醇提取法测定不同葡萄品种叶片中可溶性蛋白、可溶性糖和叶绿素的含量,并通过线性回归法分析这些物质含量与葡萄对绿盲蝽抗性的关系。【结果】不同葡萄品种对绿盲蝽的抗性水平不同,按抗性指数从小到大依次为红地球、玫瑰香、巨峰、赤霞珠、品丽珠、红宝石、蛇龙珠、藤稔和霞多丽;不同葡萄品种叶片中可溶性蛋白、可溶性糖和叶绿素含量存在差异;可溶性蛋白和叶绿素含量与抗性指数之间没有显著相关性,而可溶性糖含量与抗性指数之间存在显著负相关(P<0.05)。【结论】不同葡萄品种对绿盲蝽的抗性存在显著差异,藤稔和霞多丽对绿盲蝽具有较高抗性,而红地球、玫瑰香和巨峰则较为敏感,该差异可能与葡萄叶片中可溶性糖的含量有关。