摘要:

摘要: 为了明确ghrelin是否参与了卵母细胞成熟及胚胎早期发育进程,本研究利用免疫荧光技术和实时定量RT-PCR技术检测了绵羊卵母细胞和体内早期胚胎中ghrelin蛋白的表达定位和ghrelin mRNA水平相对表达变化规律。免疫荧光染色结果表明,ghrelin蛋白主要分布于卵母细胞胞质内;实时定量RT-PCR结果揭示绵羊卵母细胞和早期胚胎ghrelin mRNA的相对表达量依据发育阶段的不同而呈现一定变化规律,即在成熟卵母细胞,2细胞胚胎期和8细胞胚胎期显著高于未成熟卵母细胞和4细胞胚胎期(P<0.05),囊胚期表达量最高。卵母细胞和早期胚胎中ghrelin蛋白的表达及ghrelin mRNA特定的表达模式,揭示这一新型分子在绵羊卵母细胞成熟以及胚胎早期发育过程中具有潜在的调控作用。

摘要: 扩增人肝细胞再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,ALR)基因,利用质粒pIRES2-EGFP构建新霉素(Neo)、增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)双标记基因且EGFP和ALR基因为双顺反子的真核表达载体。LipofectAMINETM介导其转染体外培养的绵羊胎儿成纤维细胞(sheep fetal fibroblastcells,sFFCs);经G418筛选转基因细胞;激光共聚焦显微镜挑选绿色荧光单克隆细胞。PCR、RT-PCR和免疫组织化学方法进一步检测ALR基因及其表达;稳定表达外源基因的sFFCs作供体,移入去核的绵羊卵母细胞中,进行体细胞核移植。通过激光共聚焦显微镜和ALR抗体检测EGFP、ALR基因在胚胎水平上的表达,其结果表明:由IRES连接的EGFP和ALR基因可在绵羊胎儿成纤维细胞内同时表达,由此细胞核移植产生的转基因胚胎在发育的各阶段均可见绿色荧光;囊胚中所有细胞表达EGFP基因;发绿色荧光的胚胎中ALR基因同时存在。因此,由IRES连接标记基因和目的基因,以标记基因指示目的基因的表达,可简化检测目的基因的繁琐手段;用筛选的转基因早期胚胎进行移植,可提高制备转基因动物的效率。

摘要: 过渡蛋白2基因(tnp2)是圆形精子细胞特异表达的基因。为了开展绵羊圆形精子细胞标记基因的研究,根据GenBank上已公布的牛的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR和分子克隆方法,克隆了蒙古绵羊tnp2基因cDNA部分编码区序列。DNA序列测定结果与牛的核苷酸序列比对,同源性为95.3%。根据绵羊tnp2基因的cDNA序列设计引物,对共培养的四月龄绵羊睾丸生殖细胞进行RT-PCR鉴定。结果显示体外共培养的绵羊睾丸生殖细胞一直到第十周后仍有圆形精子细胞产生。绵羊tnp2基因的cDNA克隆和序列测定为进一步研究绵羊精子发生过程奠定了基础。