摘要: 【目的】本研究旨在建立携带与未携带松材线虫Bursaphelenchus xylophilus的松墨天牛Monochamus alternatus成虫各组织的转录组数据库,揭示松墨天牛对松材线虫响应的转录组整体表达特征。【方法】以携带和未携带松材线虫的松墨天牛成虫的表皮、气管和脂肪体为材料,采用Illumina HiSeq(TM) 2000测序平台开展转录组测序,利用Trinity软件对RNA-Seq数据进行从头组装,利用NCBI数据库进行基因注释。通过DEG-Seq分析携带和未携带松材线虫的松墨天牛成虫中的差异表达基因,对上调表达基因进行GO和KEGG代谢途径富集分析,并通过实时荧光定量PCR技术对部分差异表达的基因包括ENV, CDK1, HSP70-C, HSP70, HSP75, DUO, PABPN1和IGFP基因的表达水平进行验证。【结果】测序过滤后共获得55 059条单基因簇(unigene),平均长度为1 536 bp。将unigene与数据库中的序列进行BLASTX比对,成功注释24 354条unigenes,其中4 022条unigene在GO数据库中获得注释,6 098条unigene在KEGG数据库中获得注释。经过GO与KEGG富集分析显示,松墨天牛成虫携带松材线虫后,差异表达基因主要为与其气管中压力调节、组织与DNA修复、激素响应方面相关的基因。实时荧光定量PCR分析结果显示CDK1, HSP70, HSP75, DUO, PABPN1和IGFP基因的表达量在携带松材线虫的松墨天牛气管中相比未携带松材线虫的松墨天牛气管中的显著上调。【结论】本研究初步阐明松墨天牛携带松材线虫后转录组的整体表达模式,为进一步研究松墨天牛的基因功能及对松材线虫的胁迫响应过程奠定了基础。

摘要: 【目的】明确昆虫病原线虫Heterorhabditis beicherriana LF品系(LF)与苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis HBF-18菌株(Bt HBF-18)混用后对华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita幼虫的致病力的协同增效作用,为该害虫的防治提供新的技术措施。【方法】在室内测定了LF在不同使用剂量、不同环境温度及不同土壤湿度条件下对华北大黑鳃金龟7-10日龄幼虫的致病力;通过室内生测测定了Bt HBF-18对LF存活的影响,以及Bt HBF-18与LF两者混用后对7-10日龄华北大黑鳃金龟幼虫的防治效果;同时通过室外盆栽试验测定了两者混用对华北大黑鳃金龟幼虫的防治效果。【结果】华北大黑鳃金龟幼虫死亡率随LF施用剂量和处理时间的增加而升高,其中,侵染期线虫(infective juveniles, IJs)800 IJs/100μL及以上剂量处理7 d后幼虫死亡率达到了100%;25℃为该线虫侵染的最适宜环境温度;适宜土壤湿度范围为14%20%,湿度过低或过高都会显著影响其侵染效率。室内生测结果表明, Bt HBF-18处理9 d对华北大黑鳃金龟幼虫的致死中浓度(LC_(50))为1.44×108 CFU/g土,此浓度对LF的存活基本没有影响。另外,室内生测和室外盆栽试验结果均表明,将LF与Bt HBF-18混用能显著提高对华北大黑鳃金龟幼虫的防治效果,混用后具有不同程度的加成或协同增效作用。室内生测试验中LC_(50) Bt+200 IJs/100μL LF混用处理3 d后,较单独LF和Bt HBF-18处理幼虫死亡率分别提高了约43.07%和36.05%,具有显著的协同增效作用;室外盆栽试验中1/2 LC_(50)Bt+1 000 IJs/mL LF, LC_(50)Bt+1 000 IJs/mL LF和1/2 LC_(50) Bt+1 500 IJs/mL LF均具有协同增效作用,其中1/2 LC_(50) Bt+1 500 IJs/mL LF增效作用最佳,较单独LF和Bt HBF-18处理幼虫死亡率分别提高了约38.89%和80.55%。【结论】将昆虫病原线虫LF与Bt HBF-18混用对华北大黑鳃金龟幼虫的防治具有加成或协同增效作用。

摘要: 【目的】昆虫病原线虫受到化学农药作用后,其对害虫的杀虫效果和搜寻效应可能会发生变化。本研究旨在探讨噻虫嗪处理的昆虫病原线虫对韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga幼虫(韭蛆)的杀虫效果及搜寻效应的影响。【方法】采用培养皿滤纸法,通过功能反应试验测定了噻虫嗪(15 mg/L)处理的芫菁夜蛾斯氏线虫Steinernema feltiae SF-SN (Sf)对韭蛆3龄幼虫的致死率和搜寻效应,比较噻虫嗪处理的Sf和未处理的Sf致死功能反应和搜寻效应的差异。【结果】噻虫嗪处理的Sf引起的韭蛆3龄幼虫的校正死亡率高于未处理的Sf引起的校正死亡率,处理6 h时,较未处理的Sf引起的校正死亡率提高了2.13倍。当Sf浓度固定在6 400 IJs/皿时,噻虫嗪处理的和未处理的Sf对该试虫功能反应均拟合HollingⅡ和Ⅲ型方程,与未处理的Sf相比,噻虫嗪处理的Sf对该试虫的攻击率(a′=0.5592)提高了42.46%,线虫寻找、寄生及致死该试虫所花费的总时间即处理时间(T_h=0.0081 d)则降低了44.90%,消耗率(a′/T_h)提高了2.59倍,日最大致死量(Na_(max))则分别提高了1.81倍(HollingⅡ)和1.41倍(HollingШ)。而噻虫嗪处理的和未处理的Sf对该试虫的搜寻效应均随韭蛆密度的增加而呈线性下降。当韭蛆密度固定在40头/皿时,噻虫嗪处理的和未处理的Sf对该试虫的致死效果均随着韭蛆密度的增加而增大,搜寻效应则均先上升后下降,且噻虫嗪处理的Sf的寻找参数和相互干扰参数均高于未处理Sf的。【结论】噻虫嗪处理的Sf对韭蛆3龄幼虫的校正死亡率、瞬时攻击率、消耗率、日最大致死量和搜寻效应均高于未处理Sf的,而处理时间则显著降低。

摘要: 【目的】昆虫病原线虫(entomopathogenic nematodes,EPNs)的寿命和抗逆性是影响其商品化的重要因素。本研究旨在鉴定崇明拟异小杆线虫Heterorhabditidoides chongmingensis的模式品系DZ0503CMFT(DZ)的DAF-16基因的生物学功能,探讨该基因在DZ线虫的寿命和抗逆性中的作用。【方法】根据DZ线虫和其自身共生菌Serratia nematodiphila DZ0503SBS1T(S1)及非自身共生菌S.nematodiphila DR186(186)共培养时生长发育的差异,结合已经构建的DZ线虫的数字基因表达谱(digital gene expression profile,DGE)文库,选取调控生长发育的胰岛素/类胰岛素信号通路(insulin/insulin-like growth factor signaling pathway,IIS)的主要转录输出信号DAF-16作为研究对象。通过同源性分析选取daf-16基因中特异性片段作为干扰片段,利用L4440质粒载体构建干扰片段的dsRNA表达载体,并转化到大肠杆菌Escherichia coli HT115(DE3)中。用饲喂法将daf-16dsRNA导入DZ线虫体内沉默基因;利用实时定量PCR检测RNA干扰效果,统计daf-16基因表达下调后的DZ线虫寿命、4个生理阶段的时长、抗逆性(热应激和氧化应激)以及表型(体长)和繁殖性状(48 h内产卵量、卵孵化率和雌虫率)等的变化。【结果】DZ线虫的daf-16 (GenBank登录号:MH101641) cDNA全长2 164 bp,其中开放阅读框(open reading frame,ORF)长1 353 bp,编码450个氨基酸。RNAi后DZ线虫体内的daf-16基因表达量被显著敲低,相对于对照组空载L4440降低了49.05%。RNAi组线虫平均寿命为14.96 d,比空载L4440组(17.60 d)降低了15.00%。DZ线虫daf-16 RNAi组在繁殖阶段和快速身体运动阶段的时长比空载L4440组的短,而快速咽吸阶段和咽抽吸阶段的时长比空载L4440组的长。处理7 d后DZ线虫daf-16 RNAi组在热应激(37℃)和氧化应激(10 mmol/L百草枯水溶液)处理时存活率显著低于DZ线虫的空载L4440组。在产卵量、孵化率、雌虫率和体长上daf-16 RNAi组与对照组之间没有显著差异。【结论】通过RNAi方法初步验证了DZ线虫的daf-16基因的生物学功能,该基因调控了崇明拟异小杆线虫的寿命和抗逆性。

摘要: 【目的】害虫受到病原生物、化学农药作用后,会引起其体内生理生化的变化。本研究旨在阐明昆虫病原线虫和噻虫嗪联合作用下对韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga幼虫(韭蛆)的杀虫效果及体内保护酶和解毒酶活性的影响。【方法】采用培养皿滤纸法测定了芫菁夜蛾斯氏线虫Steinernema feltiae SF-SN(Sf)(60头/幼虫)与噻虫嗪(15 mg/L)混用对韭菜迟眼蕈蚊3龄幼虫的LT_(50);采用生化分析法比较分析不同时间下两者混用对其幼虫体内酶液蛋白质含量和体内酶[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)和乙酰胆碱酯酶(AChE)]活性的影响。【结果】Sf与噻虫嗪混用处理韭菜迟眼蕈蚊3龄幼虫,其LT_(50)值为41.05 h,比单独使用Sf(LT_(50):167.93 h)和噻虫嗪(LT_(50):72.82 h)时分别缩短了126.88 h和31.77 h;处理后24-72 h,两者混用时对试虫的校正死亡率均显著高于两者单用,且在处理72 h时,校正死亡率达到96.61%。与对照组相比,两者混用处理后12,24和36 h时,韭蛆体内酶液蛋白质含量分别提高了13.88%,46.87%和57.99%,均显著高于对照组、Sf处理组和噻虫嗪处理组。处理24 h时,两者混用组SOD,CAT,AChE和GTSs活性分别比对照降低了47.48%,28.73%,71.04%和29.97%;处理36 h时,酶活性分别比对照降低了46.34%,42.22%,58.37%和11.87%,均显著低于对照组、Sf处理组和噻虫嗪组,比单剂具有更强的抑制作用。【结论】Sf和噻虫嗪联合作用韭菜迟眼蕈蚊3龄幼虫后,其LT_(50)值比两者单用时显著缩短,且对幼虫体内SOD,CAT,AChE和GSTs活性均具有更强的抑制作用。