摘要: 【目的】本研究旨在分析甜菜夜蛾Spodoptera exigua蛹卵巢细胞建立细胞系的整个过程,探究细胞由体内到体外培养过程中其基因表达在转录水平的变化,为昆虫体外培养模型的建立提供理论基础。【方法】利用Illumina Hiseq测序平台对甜菜夜蛾蛹卵巢细胞离体培养过程中各阶段的细胞分别进行转录组测序,对获得注释的差异表达基因及其相关信号通路进行分析;通过荧光定量PCR对部分细胞周期相关基因(cycd和cdk4)、调控基因(cdc20,apc1,skp2和mad1)、增殖相关分子标志物(mcm4和pcna)在甜菜夜蛾卵巢细胞离体培养过程中的转录进行验证。【结果】甜菜夜蛾蛹卵巢细胞离体培养过程包括5个阶段:解剖获得离体的卵巢组织,卵巢组织贴壁培养后游离出原代细胞,细胞转化重新具备增殖能力,成功首次传代,以及能够连续传代15代以上建立细胞系。上述5个阶段的细胞经转录组测序、数据组装后共获得46 796条unigenes序列,组装得到序列长度完整性好;转录本unigenes序列拼接长度分布合理,样本碱基Q30均在94%以上。通过KEGG数据库获得注释的unigenes有1 473条,参与细胞过程紧密相关的20条信号通路,其中有92条unigenes在细胞周期信号通路中获得注释。聚类分析表明,在体内处于快速发育状态的卵巢细胞与同样处于增殖状态的细胞系基因表达模式非常接近。原代细胞由短暂停滞生长至成簇细胞的转化关键期,筛选到差异表达基因619个,cdk4在离体培养期表达量显著降低,cycd在细胞转化关键期之后表达量显著升高,cdc20,apc1,skp2和mad1在卵巢组织和细胞系的表达量显著高于原代细胞、转化关键期细胞和首次传代细胞的。从原代细胞至传代后,cycd的表达显著升高8.7倍,显著高于mcm4和pcna的变化水平。【结论】甜菜夜蛾卵巢细胞离体培养过程中5个阶段的细胞转录组测序获得的序列质量符合数据分析的基本要求。筛选获得了甜菜夜蛾蛹卵巢细胞经离体培养过程中的差异表达基因。原代细胞逆转增殖可能与cdk4,cycd,skp2和mad1等细胞周期调控基因表达有关。另外,cycd可作为原代细胞具备传代能力的标志物。

摘要: 【目的】本研究旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，探索甜菜夜蛾Spodoptera exigua谷氨酸门控氯离子通道(glutamate-gated chloride channels, GluCls)基因不同转录变异体编码的SeGluCls对杀虫剂敏感性是否存在差异。【方法】采用RT-PCR和RACE技术获得甜菜夜蛾SeGluCl的全长cDNA序列，并对其进行生物信息学分析；利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除SeGluCl两个剪接变异体SeGluCl 3a和SeGluCl 3b,并构建甜菜夜蛾敲除品系(3a-KO和3b-KO),生物测定甜菜夜蛾敏感品系WH-S(对照品系)及3a-KO和3b-KO品系的3龄幼虫对阿维菌素、甲维盐和氟虫腈3种杀虫剂敏感性的差异。【结果】获得了甜菜夜蛾SeGluCl全长cDNA序列，并发现其2种剪接变异体(SeGluCl 3a和SeGluCl 3b),SeGluCl 3a(GenBank登录号：OM304353)的开放阅读框(open reading frame, ORF)长1 362 bp,编码454个氨基酸，SeGluCl 3b(GenBank登录号：OM304354)的ORF长1 365 bp,编码455个氨基酸。两种剪接变异体SeGluCl 3a和SeGluCl 3b编码的SeGluCls都包含4个跨膜区和1个半胱氨酸环。系统发育分析表明，SeGluCl与斜纹夜蛾S.litura和草地贪夜蛾S.frugiperda的GluCl亲缘关系最近。与对照品系WH-S相比，3a-KO和3b-KO敲除品系对阿维菌素、甲维盐和氟虫腈的敏感性无显著差异。【结论】甜菜夜蛾SeGluCl剪接变异体SeGluCl 3a和SeGluCl 3b编码的SeGluCls对阿维菌素、甲维盐和氟虫腈这3种杀虫剂的敏感性无差异。

摘要: 【目的】本研究旨在阐明甜菜夜蛾Spodoptera exigua幼虫体内肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein, PGRP)在响应苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)感染过程中的功能。【方法】利用PCR方法扩增甜菜夜蛾幼虫肽聚糖识别蛋白基因SePGRP-SA全长cDNA;采用qRT-PCR分析SePGRP-SA在甜菜夜蛾不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、预蛹和蛹)及4龄幼虫不同组织(中肠、马氏管、围食膜、脂肪体、血淋巴和表皮)中的表达。通过RNAi技术沉默SePGRP-SA基因72 h后，qRT-PCR检测SePGRP-SA沉默效率及甜菜夜蛾4龄幼虫中肠抗菌肽相关基因(Ceropin,Attacin和Defensin)和细菌载量的变化。RNAi沉默SePGRP-SA 24 h后，以苏云金芽胞杆菌菌株Bt-GS57饲喂甜菜夜蛾4龄幼虫0, 24, 48, 72, 96和120 h,计算幼虫校正死亡率；饲喂甜菜夜蛾4龄幼虫Bt-GS57后0, 24, 48和72 h,利用qRT-PCR检测中肠SePGRP-SA,Ceropin,Attacin和Defensin的相对表达量。【结果】克隆获得甜菜夜蛾SePGRP-SA全长DNA(GenBank登录号：MW265930),开放阅读框长576 bp,编码191个氨基酸，其编码蛋白的预测分子量为21.59 kD。序列分析结果表明，SePGRP-SA具有典型的PGRP和Ami2保守结构域，信号肽为19个氨基酸，为分泌型蛋白；系统进化分析发现，SePGRP-SA与斜纹夜蛾Spodoptera litura的SlPGRP亲缘关系最近，氨基酸序列一致性达91.1%。发育表达谱结果表明SePGRP-SA在甜菜夜蛾4和5龄幼虫、预蛹和蛹中高表达；组织表达谱结果表明，SePGRP-SA在4龄幼虫各组织中均表达，其中以血淋巴中表达量最高。与注射dsEGFP(对照)相比，注射dsSePGRP-SA的甜菜夜蛾4龄幼虫在72 h时中肠SePGRP-SA基因表达量下调了95.26%,Cecropin,Attacin和Defensin表达量显著下调，中肠细菌载量显著升高。注射dsEGFP和dsSePGRP-SA的甜菜夜蛾4龄幼虫饲喂Bt-GS57,72 h时幼虫校正死亡率分别为50.00%和73.33%,表明幼虫对Bt-GS57的敏感性明显增加。甜菜夜蛾4龄幼虫取食Bt-GS57后，中肠SePGRP-SA,Cecropin,Attacin和Defensin表达量在48 h均显著增加，72 h时降低。【结论】Bt侵染能够引起甜菜夜蛾SePGRP-SA基因激活抗菌肽相关基因Cecropin,Attacin和Defensin的表达。

摘要: 【目的】本研究旨在明确甜菜夜蛾Spodoptera exigua半胱天冬酶(caspase)在细胞凋亡诱导剂诱导和病原微生物胁迫下的表达模式,为丰富鳞翅目昆虫细胞凋亡机制研究奠定基础。【方法】利用RT-PCR技术从甜菜夜蛾3龄幼虫体内扩增两个半胱天冬酶基因(SeCasp-3和SeCasp-4)编码区的全长;利用qPCR技术分别检测两个半胱天冬酶基因在细胞凋亡诱导剂过氧化氢(hydrogen peroxide, H_2O_2)(100μmol/L)、放线菌素D(actinomycin D, ActD)(10μg/mL)和地塞米松(dexamethasone, DEX)(50μg/mL)诱导后甜菜夜蛾脂肪体细胞中及病原菌苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis kurstaki(Btk)(108个细菌/mL)、大肠杆菌TG1菌株Escherichia coli TG1 (E.coli TG1)(108个细菌/mL)、烟芽夜蛾囊泡病毒3h株(Heliothis virescens ascovirus 3h, HvAV-3h)(1.16×10(11)个基因组拷贝/mL)和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)(5 000 OBs/μL)感染后甜菜夜蛾3龄幼虫体内的表达模式。【结果】SeCasp-3(GenBank登录号:MW183334)的编码区长942 bp,共编码313个氨基酸;SeCasp-4(GenBank登录号:MW183335)的编码区长843 bp,共编码280个氨基酸。SeCasp-3和SeCasp-4的假定蛋白序列与家蚕Bombyx mori Dronc的氨基酸序列一致性分别为45.54%和58.46%,且SeCasp-3和SeCasp-4之间具有较高的同源性。SeCasp-3和SeCasp-4在不同化学物质诱导下的甜菜夜蛾脂肪体细胞中的表达模式存在明显差异,在100μmol/L H_2O_2和10μg/mL ActD处理后24和48 h,脂肪体细胞中SeCasp-3和SeCasp-4的相对表达量均显著升高;50μg/mL DEX处理后24和48 h,SeCasp-3的相对表达量未见显著变化,但SeCasp-4的相对表达量升高了数千倍。在不同病原微生物感染后的甜菜夜蛾3龄幼虫体内,SeCasp-3和SeCasp-4的表达模式基本相同。一般线性模型的分析结果表明,Btk和E.coli TG1的感染不造成SeCasp-3和SeCasp-4相对表达量的显著变化,而HvAV-3h和AcMNPV的感染则显著抑制了这两个基因的表达。【结论】本研究鉴定了两个甜菜夜蛾半胱天冬酶基因,并分析了其对细胞凋亡诱导剂和病原微生物感染的表达响应,为进一步探究半胱天冬酶功能和昆虫细胞凋亡过程提供了重要的理论基础。

摘要: 【目的】线粒体通透性转换孔(MPTP)的开放可以导致线粒体膜通透性改变,与细胞凋亡关系密切。本研究旨在探索MPTP在喜树碱诱导的昆虫细胞凋亡中的作用,以进一步揭示喜树碱(CPT)诱导昆虫细胞凋亡的机制。【方法】环孢菌素A(CsA)为MPTP开放抑制剂,通过预加入20μmol/L CsA,应用流式细胞仪测定其对CPT和羟基喜树碱(HCPT)诱导的甜菜夜蛾Spodoptera exigua细胞(IOZCAS-SPEX-Ⅱ)凋亡作用的影响,包括细胞内Ca(2+)浓度变化,线粒体膜电位变化以及活性氧簇(ROS)变化,从而分析MPTP在CPT和HCPT诱导细胞凋亡的作用。【结果】结果显示,10μmol/LCPT和HCPT处理IOZCAS-SPEX-Ⅱ细胞6 h和12 h时,与0.1%DMSO对照组相比,甜菜夜蛾细胞发生凋亡,胞质Ca(2+)浓度增大,线粒体膜电位降低或丧失,ROS增加,即CPT和HCPT诱导甜菜夜蛾细胞发生凋亡,为线粒体内途径。但经过20μmol/L CsA预处理2 h后再加入CPT和HCPT处理6 h,与0.1%DMSO组相比,细胞凋亡率、胞质Ca(2+)浓度、线粒体膜电位及ROS产生均无显著差异(P>0.05),即CsA抑制了MPTP的开放,从而抑制了CPT和HCPT诱导的甜菜夜蛾细胞凋亡;而加入CPT和HCPT处理12 h时,CsA对MPTP开放的抑制作用显著降低,与单CPT和HCPT处理组相比,细胞凋亡率、胞质Ca(2+)浓度、线粒体膜电位及ROS差异不显著,即CPT和HCPT诱导的细胞凋亡如常发生。【结论】本研究证实喜树碱和羟基喜树碱诱导甜菜夜蛾细胞凋亡线粒体途径具有MPTP开放依赖性,且首次明确这种依赖性具有时间性。