摘要: 【目的】本研究旨在鉴定灰飞虱Laodelphax striatellus中的IκB激酶(IκB kinase, IKK)相关基因,并调查其在灰飞虱抗病毒中的作用,以进一步深入理解传毒介体应对植物病毒的先天免疫机制。【方法】通过生物信息学鉴定了灰飞虱基因组中IKK相关基因;以无毒及水稻条纹病毒(rice stripe virus, RSV)侵染的灰飞虱为材料,利用RT-PCR方法检测IKK相关基因在无毒灰飞虱各个龄期(卵、1-5龄若虫、雄成虫和雌成虫)及成虫不同组织(肠道、唾液腺、血淋巴、脂肪体、卵巢和精巢)中的表达量;利用qRT-PCR方法检测无毒以及RSV侵染后的灰飞虱IKK相关基因在各个龄期及成虫不同组织中的表达量;通过对3龄若虫注射IKK基因dsRNA进行RNA干扰后,利用qRT-PCR检测带毒灰飞虱中表示病毒含量的RSV外壳蛋白(CP)基因转录水平。【结果】在灰飞虱基因组中鉴定到了两个IKK相关基因即IKKα(GenBank登录号:MK903504)和TANK结合激酶1(TANK-binding kinase1)基因TBK1(GenBank登录号:MN124506)。IKKα开放阅读框长2 379 bp,编码792个氨基酸;TBK1开放阅读框长1 551 bp,编码516个氨基酸。两个基因编码的蛋白都具有1个保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和1个泛素折叠结构域。RT-PCR结果表明,IKKα和TBK1在无毒灰飞虱各个龄期及成虫不同组织中均有表达。qRT-PCR分析结果表明,IKKα和TBK1在RSV侵染后的灰飞虱各个龄期及成虫不同组织中的表达水平与其在无毒灰飞虱中的表达量之间存在明显差异。进一步将RSV侵染后的灰飞虱3龄若虫中的IKKα和TBK1干扰后,带毒灰飞虱中的RSV含量显著上升。【结论】本研究结果表明, NF-κB信号途径中的两个重要基因IKKα和TBK1在灰飞虱中广泛表达,且在灰飞虱抵御RSV的侵入过程中可能具有重要功能。这些结果为今后进一步深入研究NF-κB免疫通路在灰飞虱抗病毒中的功能提供了丰富的基础信息。

摘要: 【目的】本研究旨在明确我国东北地区灰飞虱Laodelphax striatellus种群遗传变异及种群遗传结构,阐明种群间遗传分化与基因流。【方法】利用9对微卫星引物对采自我国东北地区15个地理种群的375头灰飞虱样品进行测序与分析;利用GeneAlex6.51, GENEPOP4.0.9和STRUCTURE 2.3.4等软件分析灰飞虱地理种群间的遗传多样性、遗传分化、基因流及种群遗传结构。【结果】在所分析的375头灰飞虱个体中,各位点平均有效等位基因数Na=6.898;总体上,灰飞虱不同地理种群遗传多样性较高(平均观测杂合度Ho=0.548;平均期望杂合度He=0.582),各种群间基因流较低(Nm=0.660)。UPGMA聚类树、PCoA及STRCTURE分析结果表明,东北地区灰飞虱种群分为两分支:吉林(JL)和沈阳(SY2012,SY2013和SY2014)种群聚为一支;其余种群聚为一支。AMOVA分析结果表明,灰飞虱遗传变异主要来自种群内(87%),种群间变异水平较低(13%)。【结论】中国东北地区灰飞虱遗传多样性较高,不同地理种群存在一定程度的遗传分化,且基因交流较低,存在一定的种群遗传结构。

摘要: 【目的】前期发现水稻条纹病毒(rice stripe virus,RSV)可与介体灰飞虱Laodelphax striatellus体内的Hi PV病毒(Himetobi P virus,Hi PV)互作。本研究旨在制备Hi PV外壳蛋白VP1的多克隆抗体,并评估其在Hi PV病毒检测中的可用性,以为深入研究Hi PV-RSV和Hi PV-灰飞虱的互作机制提供技术支持。【方法】以RT-PCR方法从灰飞虱成虫体内扩增Hi PV主要外壳蛋白基因VP1,然后将VP1基因亚克隆至原核表达载体p ET-32a中,构建表达载体p ET-VP1。将重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3),经IPTG诱导、Ni2+-NTA亲和层析纯化,获得重组蛋白,免疫新西兰大白兔,制备抗体。【结果】从灰飞虱体内克隆到774 bp的Hi PV外壳蛋白基因VP1,经原核表达、纯化,获得分子量约47. 5 kD的融合蛋白,免疫新西兰大白兔后获得VP1多克隆抗体。该抗体间接ELISA效价达1∶819 200,与Hi PV外壳蛋白VP1有特异性反应,而与灰飞虱蛋白无交叉反应。利用该多克隆抗体建立了检测单头灰飞虱成虫体内Hi PV的Western blot和免疫捕获RT-PCR方法,检测结果显示Hi PV在携带和不携带RSV的灰飞虱高亲和性群体内均广泛存在。【结论】利用制备的Hi PV的VP1多克隆抗体可特异性检测灰飞虱体内Hi PV。本研究为Hi PV病毒的快速检测以及Hi PV-RSV互作、Hi PV-灰飞虱互作研究提供了技术支持。

摘要: 【目的】灰飞虱Laodelphax striatellus种群存在长翅和短翅个体,其翅型分化受遗传和环境条件的影响。本研究旨在明确经连续定向选育的灰飞虱长、短翅型品系对高、低温的适应能力差异。【方法】在室内分别长期定向筛选63和65代建立灰飞虱长、短翅型品系,并在南京田间采集灰飞虱自然种群;分别在25℃,30℃和35℃恒温条件下测定上述灰飞虱长、短翅型品系和自然种群的繁殖力、存活率和发育历期,测定若虫在5℃和-20℃下的存活率以及若虫和成虫的过冷却点,通过品系间存活率、发育历期、生殖力和过冷却点的比较分析,确定灰飞虱长、短翅型品系对高温和低温的耐受能力。【结果】在25℃,30℃和35℃下,灰飞虱自然种群雌成虫的繁殖力均显著高于室内筛选后的长、短翅型品系,而长、短翅型品系雌成虫之间的繁殖力均无显著差异;长、短翅型品系的繁殖力在25℃和30℃之间均无显著差异,但自然种群在25℃下的繁殖力显著高于30℃条件下的繁殖力; 35℃下长、短翅型品系基本无若虫产生。25℃下长翅型品系、短翅型品系和自然种群若虫的存活率无显著差异,但在30℃下,短翅型品系若虫的存活率显著低于自然种群,而与长翅型品系差异不显著; 35℃下长、短翅型品系的若虫最长只能存活到3龄,且两品系间无显著差异,而自然种群可存活到5龄。25℃下,短翅型品系若虫的发育历期显著短于自然种群,而与长翅型品系无差异;但是在30℃下,短翅型品系若虫历期显著长于长翅型品系和自然种群。长翅型品系、短翅型品系和自然种群灰飞虱3-4龄若虫在5℃低温下的存活天数无显著差异,并且长翅和短翅型品系在-20℃极端低温下暴露10 min后其死亡率也无显著差异且均显著高于自然种群。3个品系(种群)成虫的过冷却点无显著差异,但5龄若虫的过冷却点表现为短翅型品系显著高于自然种群,而与长翅型品系无显著差异。【结论】经连续定向选育的灰飞虱长、短翅型品系对低温和高温的适应力基本相当,且低于自然种群。在高温条件下灰飞虱短翅型品系的发育速率低于长翅型品系。

摘要: 【目的】稻飞虱翅型调控的分子机理已较为清楚，但是在长、短翅品系不断纯化过程中翅型及翅发育基因表达水平的变化规律还不明确，因此本研究旨在阐明灰飞虱Laodelphax striatellus长、短翅品系的翅长、翅重及翅发育基因对翅型定向选择的响应，以期为明确灰飞虱翅型的遗传进化规律提供参考。【方法】在恒定条件下对灰飞虱长、短翅型分别进行14和13个连续代次的定向选择，建立长翅型和短翅型品系；测定各选择代次中两品系的长翅和短翅率、翅长和翅重；并采用qPCR方法测定翅发育基因InR1,InR2和FoxO的相对表达水平；通过比较长、短翅型品系的翅型指标和基因表达水平在各选择代次间的差异来表征翅型及翅发育基因的选择响应。【结果】长翅型和短翅型分别进行连续14和13代的定向选择，灰飞虱长翅型品系的长翅率以及短翅型品系的短翅率在各选择代次间均显著上升，均已保持在95%左右。随着选择代次的增多，长翅型品系的翅长不断增长，短翅型品系的翅长不断缩短，长、短翅型品系的翅重均呈变轻趋势。长翅型品系3龄若虫的InR1和InR2相对表达水平随选择代次的增多而下降，但FoxO相对表达水平不随选择代次变化；短翅型品系InR1,InR2和FoxO在3龄若虫中的相对表达水平随选择代次增多呈现上升趋势；这3个基因在成虫中的相对表达水平对长和短翅型的选择响应不明显。【结论】灰飞虱翅型对定向选择有明显的响应，选择翅型的比率显著上升并保持在高水平；长翅型品系经定向选择后翅变长、变薄，短翅型品系的翅则变短、变轻；多世代定向选择长翅型抑制了若虫的翅发育基因InR1和InR2的表达，而短翅型的多世代定向选择则激活了其表达，从而促进翅型纯系的形成与保持。研究结果预示灰飞虱种群能向长、短翅型纯系两个方向进化。