摘要: 【目的】沙葱萤叶甲Galeruca daurica是一种近年来在内蒙古草原上猖獗成灾的新害虫。本研究旨在克隆沙葱萤叶甲钙结合蛋白(calcium-binding protein,CaBP)基因,分析其在沙葱萤叶甲成虫不同发育阶段及不同温度下的表达谱,为进一步探究其在沙葱萤叶甲生长发育及滞育过程中的作用奠定基础。【方法】根据沙葱萤叶甲转录组和蛋白质组数据,筛选CaBP基因序列信息,应用RT-PCR技术克隆获得CaBP基因的开放阅读框(ORF)全长序列,并对其进行生物信息学分析;通过qPCR检测其在沙葱萤叶甲成虫不同日龄(羽化后3,7,10,15,20,30,40,60,90和110 d)及3日龄成虫在不同温度(0,5,10,15,20,25,30和35℃)下处理1 h后的表达水平。【结果】克隆得到4条具有完整ORF的沙葱萤叶甲CaBP基因cDNA序列,分别命名为GdCaM,GdCAPSL,GdTnCl和GdCRT(GenBank登录号:MN695412-695415),ORF全长分别为480,648,516和1 209bp,分别编码149,215,171和402个氨基酸;只有GdCRT拥有信号肽。同源序列比对和系统发育分析表明,GdCaM,GdCAPSL,Gd Tn Cl和GdCRT分别与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera的CaM,CAPSL,TnCl及马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata CRT的氨基酸序列一致性最高,分别为100.0%,74.0%,88.2%和92.5%。q PCR结果表明,4个CaBP基因在沙葱萤叶甲不同日龄成虫中均差异表达,且表达模式不同。GdCaM在成虫滞育前(羽化后3 d)表达量较高,进入滞育后(羽化后7 d)表达量降低,在滞育期间(羽化后7-60 d)表达量变化较小,而解除滞育后(羽化后90 d)表达量进一步下调。GdCAPSL在滞育初期(羽化后10 d)维持在最低水平,进入滞育中后期(羽化后40和60 d)开始回升,滞育解除后又突然下调至最低水平,而羽化后110 d急剧上升至最高水平。GdTnCl在滞育初期(羽化后15-20 d)高表达,进入滞育中后期(羽化后30-60 d)急剧下降至最低水平,滞育解除后再次上调,但羽化后110 d突然下调至最低水平。GdCRT在进入滞育后表达量开始逐渐下调,在滞育维持期间(羽化后15-60 d)维持在低水平,滞育解除后又开始上升。温度对3日龄成虫中除GdCRT外的其他3个CaBP基因的表达有显著影响。温度低于20℃时,GdCaM的表达量随温度的降低而升高,但0℃时突然下降;温度高于20℃时,GdCaM的表达量随着温度的升高而上升。GdCAPSL的表达量随着温度的升高而呈现上升的趋势,25℃时达到最高,然后下降。GdTnCl随着温度的升高,表达量呈现下降的趋势。【结论】钙结合蛋白可能在沙葱萤叶甲成虫生长发育及夏滞育调控过程中发挥着重要作用。

摘要: 【目的】表皮蛋白是昆虫体壁的主要组成部分,在昆虫生长发育中起着重要的作用。本研究旨在鉴定沙葱萤叶甲Galeruca daurica表皮蛋白基因,分析其表达模式,以期为进一步研究其在沙葱萤叶甲生长发育中的作用提供必要的基础。【方法】根据本实验室组装的沙葱萤叶甲转录组测序数据,应用生物信息学方法鉴定表皮蛋白基因全长开放阅读框(ORF);采用RT-qPCR技术测定鉴定的8个表皮蛋白基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段和3龄幼虫不同组织(头部、体壁、消化道和脂肪体)中的表达谱。【结果】基于转录组数据鉴定到8条沙葱萤叶甲表皮蛋白基因的开放阅读框(ORF)全长序列,命名为GdauCP1-8(GenBank登录号:MN629000-MN629007),ORF长417810 bp,编码138269个氨基酸,预测分子量为1528 kD,等电点pI为4.458.62;具有1620个氨基酸的信号肽;GdauCP1具有典型的跨膜结构,其余7个GdauCP蛋白无跨膜结构。同源序列比对和系统发育分析表明,GdauCP3与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata CP的氨基酸序列一致性最高,为60.00%;其余的GdauCPs与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera CP的氨基酸序列一致性最高,为58.52%80.00%。GdauCP1-4属于RR-2亚家族,GdauCP5-7属于RR-1亚家族,GdauCP8的亚家族归属未确定。RT-qPCR分析表明,8个GdauCP基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段及3龄幼虫不同组织内均有表达,且表达量存在显著差异。GdauCP2,GdauCP4,GdauCP5和GdauCP6在1龄幼虫期高表达,GdauCP3,GdauCP7和GdauCP8在蛹期高表达,GdauCP1在3龄第3天幼虫期高表达;除GdauCP2在成虫中表达水平较高外,其他GdauCP基因在成虫中的表达水平均很低。GdauCP1在头部和体壁中高表达,GdauCP2和GdauCP8在脂肪体中高表达,GdauCP3,GdauCP4,GdauCP6和GdauCP7在消化道中高表达,而GdauCP5在体壁中高表达。【结论】8个GdauCP基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段和组织间差异表达,且表达模式不同,意味着不同GdauCP可能具有不同的功能。

摘要: 【目的】丝氨酸蛋白酶(serine protease,SP)是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶。本研究旨在克隆获得沙葱萤叶甲Galeruca daurica丝氨酸蛋白酶基因,分析其对温度胁迫的响应,以期为进一步揭示沙葱萤叶甲耐温性的调控机制及其他生理功能奠定基础。【方法】根据沙葱萤叶甲2龄幼虫转录组数据,采用RACE技术克隆得到沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析;应用qPCR技术检测其在不同温度(-10,-5,0,5,25和35℃)下处理1 h后及25℃下恢复30 min后在沙葱萤叶甲2龄幼虫中的表达量变化。【结果】自沙葱萤叶甲克隆获得一个丝氨酸蛋白酶基因,命名为GdSP(GenBank登录号:MG797556)。该基因全长1 110 bp,开放阅读框969 bp,编码322个氨基酸;蛋白预测分子量35.41 kD,等电点5.61;编码蛋白具有丝氨酸蛋白酶的典型特征,具有一个跨膜结构,无信号肽。同源序列比对和系统发育分析表明,GdSP与光肩星天牛Anoplophora glabripennis SP的同源性最高,氨基酸序列一致性为30.53%。qPCR测定结果表明,不同温度处理间2龄幼虫中GdSP表达量差异不显著,但对各高低温(-10℃除外)胁迫处理回温后GdSP表达量显著上升。【结论】快速冷驯化对沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因表达无显著影响,而回温可诱导其上调表达。

摘要: 【目的】明确沙葱萤叶甲Galeruca daurica成虫在越夏不同阶段主要生理生化指标变化的特点,为进一步揭示其越夏的机理提供基础。【方法】分别采用蒽酮硫酸法和氯仿-甲醇法测定越夏不同阶段(越夏前、越夏期和越夏后)的沙葱萤叶甲成虫体内总糖、海藻糖、糖原、脂肪及水分含量;采用考马斯亮蓝G-250染色法测定总蛋白含量。【结果】总糖、水分和总蛋白含量在沙葱萤叶甲成虫越夏前(分别为26.81μg/mg,77.47%和63.17μg/mg)和越夏后(分别为26.4126.85μg/mg,75.29%76.65%和59.5364.93μg/mg)显著高于越夏期(分别为18.7721.14μg/mg,61.50%67.20%和39.8252.54μg/mg),而糖原含量变化趋势正好相反(越夏前:8.43μg/mg;越夏后:5.916.14μg/mg;越夏期:10.1811.58μg/mg),脂肪含量在越夏后(11.48%11.65%)显著低于越夏前(42.48%)和越夏期(36.05%64.79%);脂肪和总蛋白含量在越夏期间逐渐下降,而水分、总糖和糖原含量变化不明显;海藻糖含量在越夏不同阶段波动较大(2.6625.31μg/mg)。【结论】脂肪和糖原是沙葱萤叶甲成虫越夏的主要能源物质。

摘要: 【目的】沙葱萤叶甲Galeruca daurica是一种在内蒙古草原上爆发成灾的新害虫。昆虫的化学感受蛋白(CSPs)是一类水溶性小分子蛋白,其主要功能是识别和传导环境中的化学刺激至受体,参与众多昆虫行为。本研究旨在鉴定沙葱萤叶甲化学感受蛋白基因,并对其表达谱进行分析。【方法】通过筛选本实验室组装的沙葱萤叶甲转录组鉴定沙葱萤叶甲化学感受蛋白基因;采用实时荧光定量PCR方法分析其在沙葱萤叶甲不同发育阶段(卵、1-3龄幼虫、蛹和成虫)和成虫组织[触角、头(去触角)、胸、腹、足和翅]中的表达水平。【结果】鉴定出10个化学感受蛋白基因,将其命名为Gdau CSP1-10(Gen Bank登录号:KY885471-KY885480)。10条编码蛋白的氨基酸序列一致性范围为17.27%62.79%,彼此间分化程度较高。通过NCBI的Blast比对结果显示,Gdau CSPs与榆黄毛萤叶甲Pyrrhalta maculicollis的Pmac CSP氨基酸序列一致性最高,为90%。系统发育分析表明,4种Gdau CSPs首先与榆黄毛萤叶甲的Pmac CSPs聚为一支。实时荧光定量PCR结果显示,Gd CSPs在不同发育阶段中的表达量有显著差异,Gdau CSP4-5,Gdau CSP7-8和Gdau CSP10 5个Gd CSPs在成虫中的表达量显著高于其他发育阶段,而Gd CSP2在卵中的表达量显著高于其他发育阶段;Gd CSPs不仅表达于成虫触角中,在头(去触角)、胸、腹、足、翅等其他部位也有表达,且10个Gd CSPs在沙葱萤叶甲成虫各组织中有着不同的表达谱,其中Gdau CSP2,Gdau CSP4,Gdau CSP5,Gdau CSP8和Gdau CSP9 5个Gd CSPs在雌成虫触角中的表达量显著高于其他组织。【结论】结果提示化学感受蛋白在沙葱萤叶甲的生长发育和化学感受过程中可能起着不同的作用。本研究为进一步研究沙葱萤叶甲化学感受蛋白的生理功能及化学通讯的分子机理奠定了必要的基础。