摘要: 应用cDNA文库筛查及同源片段克隆拼接技术,克隆了池蝶蚌组织蛋白酶L(Hs-CtsL)cDNA基因全长序列(GenBank注册号为JN604558)。其cDNA全长1152 bp,5′-非翻译区(Untranslated Region,UTR)长1 bp,3′-UTR长149 bp包括1个多聚腺苷信号AATAAA和Poly(A)尾巴,开放阅读框(Open reading frame ORF)为1002 bp,编码333个氨基酸组成的多肽链。其分子量约37.7 kD,理论等电点为7.16,包含信号肽、前体域和成熟域。系统进化分析显示,Hs-CtsL同无脊椎动物组织蛋白酶L聚为一支,且同三角帆蚌亲缘关系最近,其次为褶纹冠蚌。组织表达分析结果显示,池蝶蚌组织蛋白酶L在肠、鳃、性腺、外套膜、斧足、闭壳肌、血细胞、肝胰腺、肾和心脏均有表达,其中血细胞中表达量最高。应激实验表明,经嗜水气单胞菌刺激后,Hs-CtsL在血细胞、鳃、肝胰腺和外套膜中的表达量显著上调。其中在肝胰腺中刺激后6h表达量到达峰值,在血细胞、鳃和外套膜中的表达模式近似,表现为一个波动变化,在4h、12h和48h被上调。结果暗示着Hs-CtsL除参与了池蝶蚌血细胞的先天性免疫防御以外,还参与了其消化腺免疫器官的免疫应答反应。

摘要: Sox基因家族在胚胎发育过程和性别分化中起重要作用,为研究池蝶蚌中Sox基因的功能,以人SRY基因HMG-box保守区的序列设计简并引物,以雌、雄池蝶蚌基因组DNA和精巢cDNA为模板进行扩增,获得了2个不完全相同的序列,分别为DNA-HMG1、DNA-HMG2和cDNA-HMG,长度均为220 bp,编码73个氨基酸。与人等物种Sox1、Sox2、Sox3及Sox14有很高的同源性,雌雄个体之间没有序列差异性。采用RACE-PCR扩增获得了池蝶蚌性腺Sox2部分cDNA片段,长度为1774 bp,该序列核苷酸与欧洲帽贝的SoxB和人类的Sox2的同源性最高;在部分开放阅读框249个氨基酸残基中,具有Sox家族典型的HMG-box结构域,与人类、小鼠、原鸡和斑马鱼等Sox2的HMG-box同源性为98%。为了解该基因在各组织中的表达情况,采用实时荧光定量PCR方法分析了外套膜、闭壳肌、鳃、肠、肝、肾、精巢和卵巢在内的8种组织hs-Sox2的表达情况,结果显示,hs-Sox2基因在8种组织中均有表达,其中在肾脏中的表达量最高,其次是肠与闭壳肌,在雄性性腺中的表达量明显高于雌性性腺,在肝脏中的表达量最低;为了解hs-Sox2在不同性腺发育时期的表达情况,采用实时荧光定量PCR方法分析了5个不同月龄的精巢组织中hs-Sox2的表达情况,结果显示在39月龄性腺的表达量最高,其次是16月龄性腺,63月龄蚌中的表达量最少。以上结果表明,hs-Sox2基因可能参与了池蝶蚌精巢的发育及功能的维持。

摘要: 实验利用灭活的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)诱导处于四龄池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)14h,将诱导后的池蝶蚌血细胞的总RNA进行逆转录,用LD-PCR法合成双链cDNA,从而首次成功构建池蝶蚌血细胞的全长cDNA文库。原始文库的滴度为4×106 cfu/cm3,重组率为90%,扩增后文库的滴度为3.55×109 pfu/mL。目前文库已随机测序672个样品,将所得双向序列进行拼接,去除载体,并多序列比对去除重复序列后,发现436条为已知功能序列,其余为未知功能序列。序列中最小长度270 bp,最大长度为2153 bp,平均大小608.6 bp,表明插入片段大小理想。从文库中筛选获得免疫相关基因池蝶蚌亲环蛋白A(HsCyp A)全长基因并进行序列分析。结果显示,HsCyp A全长1229 bp,序列包括52 bp的5′非编码区、495 bp的开放阅读框、682 bp的3′非编码区和29 bp的poly(A)尾,没有明显的加尾信号。对Cyp A氨基酸序列二级结构进行了较详细的分析并进行了三维建模,同时构建了其系统进化树,分析表明亲环蛋白家族是一个在进化上非常保守的蛋白家族。综合分析,Cyp A在水生动物中不仅仅只是一种组成型蛋白,而是可能在病原感染防御中发挥重要作用。

摘要: 研究分析了池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)亲环蛋白A(Cyclophilin A,Cy PA)诱导的应激反应和对Hela细胞生长的影响。采用嗜水气单胞杆菌诱导刺激池蝶蚌,并利用Real-time PCR技术对其肝脏、性腺和血淋巴中Cy PA基因m RNA的表达量进行分析,应激实验表明,在嗜水气单胞杆菌刺激后血淋巴、肝脏和性腺中的Cy PA在诱导4h出现一个表达峰,8h后开始下降,说明池蝶蚌Hs Cy PA基因参与免疫防御应答反应;利用p ET-32a(+)表达载体,根据Hs Cy PA基因c DNA的序列,构建了含有完整开放阅读框(ORF)的表达载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达,优化诱导条件后,通过亲和层析获得了含量较高的上清可溶性蛋白;采用MTT法,将原核表达的重组Cy PA蛋白稀释到相应(50、100、200、400和800 ng/m L)浓度,刺激Hela细胞系后发现,重组池蝶蚌Cy PA蛋白能促进Hela细胞生长,刺激浓度为100 ng/m L时,达到最大增殖率18.5%。结果初步表明,池蝶蚌Cy PA是一个既参与免疫应激又对细胞的生长发育具有影响的功能广泛的蛋白质。

摘要: 研究首次获得淡水珍珠贝池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)的致雄性化基因feminization-1C亚型,即fem-1c基因,并进行全长克隆及序列分析。从转录组中Race-PCR扩增fem-1c基因全长cDNA序列,用生物信息学方法对fem-1c基因进行基因组结构分析、多序列同源性比较、跨膜区段、亲疏水性分析、功能结构域预测等。研究结果如下:该cDNA序列全长2328 bp,包含一个1869 bp的最大开放阅读框,编码622个氨基酸,经同源比对和进化树分析,fem-1基因c亚型编码的氨基酸与太平洋牡蛎的同源性最高,为79%;疏水性分析显示该蛋白为亲水性蛋白;二级结构预测发现该蛋白有大量的α螺旋和随机卷曲,形成9个锚蛋白重复序列(Ankyrin repeat,ANK),同时,三级结构预测中可以清楚的看到9个ANK模体,跟SMART预测的结构位点结果相近。从无脊椎动物到脊椎动物fem-1c基因的保守性表明它们有共同的起源,暗示这个基因家族在功能上具备保守性,推测池蝶蚌fem-1c基因可能具备与线虫fem-1基因在性别决定方面上相似的功能。