摘要: 【目的】本研究旨在解析ATP合酶亚基α(ATP synthase subunit α, ATPs-α)在棉铃虫Helicoverpa armigera变态和发育中的功能机理。【方法】PCR扩增棉铃虫ATPs-α基因开放阅读框，并进行生物信息学分析；利用qRT-PCR检测HaATPs-α在棉铃虫5龄蜕皮期和6龄第1-5天幼虫表皮、中肠和脂肪体中及外源20-羟蜕皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)(0.1 mg/mL)处理后6龄幼虫表皮和脂肪体中的表达量；对棉铃虫6龄幼虫注射dsHaATPs-α,分析RNAi降低HaATPs-α的表达量对幼虫发育及变态及其体内ATP含量、海藻糖和葡萄糖含量以及海藻糖酶活性的影响。【结果】棉铃虫HaATPs-α的开放阅读框长1 677 bp,棉铃虫、草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda、斜纹夜蛾S.litura和粉纹夜蛾Trichoplusia ni这4种鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)昆虫的ATPs-α氨基酸序列一致性为96.56%,且亲缘关系较近。表达模式分析结果显示，HaATPs-α在6龄第3天幼虫表皮和中肠中表达量最高，在5龄蜕皮期脂肪体中出现表达高峰；20E(0.1 mg/mL)处理较对照显著上调6龄幼虫中HaATPs-α的表达量。与对照组(注射dsGFP)相比，利用RNAi敲低HaATPs-α表达量后，幼虫发育迟缓，幼虫体重显著下降，幼虫死亡率显著升高，化蛹率和成虫羽化率显著降低，ATP含量和海藻糖酶活性均显著降低，海藻糖含量显著升高，葡萄糖含量显著降低。【结论】HaATPs-α不仅控制棉铃虫ATP的产量，同时还影响着海藻糖和葡萄糖的含量，因此，HaATPs-α在幼虫变态中发挥着重要作用。本研究结果还可为将来利用ATPs-α作为有害生物防控的新靶标提供实验证据和理论依据。

摘要: 【目的】本研究旨在解析ATP合酶亚基d(ATP synthase subunit d, ATPs-d)参与海藻糖代谢调控棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫发育和变态中的功能及分子机理。【方法】PCR扩增棉铃虫HaATPs-d的开放阅读框，并利用生物信息学方法对其序列及系统发育进行分析；利用qRT-PCR检测HaATPs-d在5龄蜕皮期幼虫和6龄幼虫表皮、中肠和脂肪体中及对20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)(0.1 mg/mL)响应的6龄幼虫脂肪体和表皮中的表达量；利用荧光拍照分析HaATPs-d在草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda卵巢细胞系Sf9细胞中的亚细胞定位；采用酵母双杂交分析与HaATPs-d互作的蛋白；对棉铃虫6龄幼虫注射dsHaATPs-d,分析RNAi降低HaATPs-d的表达量对幼虫发育及变态和中肠中可溶性海藻糖酶活性和海藻糖含量的影响。【结果】棉铃虫HaATPs-d(GenBank登录号：LOC110375576)的开放阅读框长525 bp,编码174个氨基酸并具有较高的保守性，与草地贪夜蛾和斜纹夜蛾S.litura中的ATPs-d亲缘关系较近。HaATPs-d的表达高峰出现在6龄第3天幼虫表皮中，在中肠和肪体中的表达量均以在5龄蜕皮期幼虫中的最高。与对照相比，20E(0.1 mg/mL)显著上调6龄幼虫脂肪体和表皮中HaATPs-d的表达量。HaATPs-d是细胞质蛋白。与注射dsGFP对照组比较，HaATPs-d与棉铃虫可溶性海藻糖酶直接结合。棉铃虫6龄幼虫中敲低HaATPs-d的表达量导致幼虫发育迟缓，幼虫体重下降，幼虫死亡率升高，化蛹率和成虫羽化率降低，中肠中可溶性海藻糖酶活性显著下降和海藻糖含量显著上升。【结论】HaATPs-d通过与棉铃虫可溶性海藻糖酶的直接结合控制幼虫体内可溶性海藻糖酶性和海藻糖含量，进而影响幼虫变态中的糖源，最终控制幼虫的变态。

摘要: 【目的】揭示棉铃虫Helicoverpa armigera气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因Harm OBP16的组织表达谱及其重组蛋白与气味化合物的结合特性。【方法】基于棉铃虫触角转录组数据,利用PCR技术从棉铃虫成虫触角中PCR克隆气味结合蛋白基因,并进行生物信息学和系统进化分析;采用qPCR对其进行组织[头部(去除触角和喙)、胸部、腹部、足、翅、触角和喙]表达谱分析;进一步采用原核表达系统表达和纯化重组蛋白;最后采用荧光竞争结合实验测定该重组蛋白与85种候选气味物质的结合能力。【结果】从棉铃虫成虫触角中克隆得到一个Atypical OBP家族基因Harm OBP16(Gen Bank登录号:JQ753074),其开放阅读框长441 bp,编码146个氨基酸,推断的编码蛋白等电点为6.87,具有10个保守的半胱氨酸。组织表达谱结果表明,Harm OBP16在雌成虫翅中高表达。纯化后的重组蛋白Harm OBP16对植物花的挥发物香叶基丙酮(Ki=14.2μmol/L)、β-紫罗兰酮(Ki=15.2μmol/L)、辛醛(Ki=15.3μmol/L)、芳樟醇(Ki=16.8μmol/L)、(R)-(+)-柠檬烯(Ki=14.9μmol/L)和β-蒎烯(Ki=17.3μmol/L)有较强的结合能力。【结论】Harm OBP16可能在棉铃虫识别寄主植物的过程中发挥一定的作用,可为基于气味物质的棉铃虫引诱剂或驱避剂的研发提供潜在的分子靶标。

摘要: 【目的】本研究旨在明确不同棉铃虫Helicoverpa armigera种群对茚虫威的抗性水平及抗性机理,以科学有效防治这一害虫,避免其对茚虫威的抗性快速发展。【方法】采用浸叶法测定了棉铃虫不同种群,即相对敏感种群(CP)、汰选种群(TP)、沂水种群(YP)(采自山东沂水)和邯郸种群(HP)(采自河北邯郸)3龄幼虫对茚虫威抗性水平及增效醚(PBO)、脱叶磷(DEF)、顺丁烯二酸二乙酯(DEM)对茚虫威的增效作用;并测定了不同种群棉铃虫3龄幼虫体内多功能氧化酶(MFO)、羧酸酯酶(CarE)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)3种解毒酶及乙酰胆碱酯酶(ACh E)活性。【结果】CP种群对茚虫威敏感,TP,YP及HP种群对茚虫威的抗性倍数(resistence ratio,RR)分别为4.36,8.06和15.34倍,分别表现为敏感性降低、低水平抗性和中等水平抗性。在TP种群中,当棉铃虫3龄幼虫取食3种增效剂处理的叶片时,在0,6和12 h处理时间内增效作用随时间而升高,且PBO和DEF对茚虫威的增效作用优于DEM。增效剂PBO,DEF和DEM饲喂棉铃虫3龄幼虫12 h后对HP种群的增效倍数分别为3.86,2.52和4.57倍,对CP种群增效作用分别为1.11,0.52和0.91倍。酶活力对比研究发现,HP种群的棉铃虫MFO,CarE和GST活性显著高于CP种群和TP种群,YP种群的棉铃虫MFO和CarE活性显著高于CP种群,CarE活性显著低于HP种群,但是ACh E活性在棉铃虫种群间差异不显著。【结论】结果提示,当达到中等抗性水平时,MFO,CarE和GST活性显著升高与棉铃虫对茚虫威的抗性有关,而代谢抑制剂PBO,DEF和DEM对茚虫威有明显的增效作用。

摘要: 【目的】长期种植转Bacillus thuringiensis(Bt)基因作物使一些靶标害虫产生了Bt抗性,有研究表明小菜蛾Plutella xylostella的white基因表达下调使其产生了Cry1Ac抗性,由于Pxwhite蛋白与ABC转运蛋白ABCG1同属于ABCG亚家族,我们推测棉铃虫Helicoverpa armigera ABCG1基因(HaABCG1)的表达下调可能与棉铃虫对Cry1Ac毒素的抗性有关。【方法】克隆并分析HaABCG1的开放阅读框(open reading frame,ORF),通过构建HaABCG1基因的表达载体检测HaABCG1蛋白在TnH_5细胞中的亚细胞定位;通过细胞毒力实验验证HaABCG1蛋白与Cry1Ac毒素的关系;利用RNAi技术验证HaABCG1表达下调是否会降低棉铃虫对Cry1Ac毒素的敏感性。【结果】棉铃虫ABCG1基因的开放阅读框长1 896 bp,编码蛋白含631个氨基酸残基,分子质量估计为69.63 k D。离体昆虫细胞表达的HaABCG1蛋白主要定位在细胞的核膜和内质网。通过RNA干扰和生物测定实验发现HaABCG1下调表达不能使棉铃虫在Cry1Ac毒素浓度为0.05μg/m L的人工饲料上正常生长,3 d后处理组和对照组棉铃虫幼虫的体重变化无显著差异。经过细胞毒力实验证明HaABCG1蛋白不介导Cry1Ac毒素对TnH_5细胞的毒力,它既不是Cry1Ac毒素的受体,也不是其他3种Bt毒素Cry1Ca,Cry2Aa和Cry1Fa的受体。【结论】HaABCG1基因表达下调与棉铃虫对Cry1Ac的抗性不相关,HaABCG1不是Cry1Ac毒素的受体。这是首次报道ABCG1基因不参与棉铃虫的Cry1Ac抗性。