摘要: 【目的】挖掘梨小食心虫Grapholita molesta幼虫中肠中高表达消化酶和解毒酶基因，为今后研究以肠道为靶标的新型农药和转基因作物提供理论依据。【方法】基于梨小食心虫4龄幼虫中肠转录组高通量测序数据的FPKM值，筛选高表达基因，进行GO功能注释和KEGG通路富集分析，并使用BLAST软件进行比对筛选高表达的消化酶和解毒酶基因，利用MEGA对这些高表达的消化酶和解毒酶及其他鳞翅目昆虫的同源蛋白进行系统发育分析。利用qRT-PCR技术对梨小食心虫幼虫不同龄期中肠中的高表达代表性消化酶和解毒酶基因表达量进行定量分析和验证。【结果】在GO数据库中注释了103 677个在梨小食心虫4龄幼虫中肠中高表达基因，包括细胞组分、分子功能和生物学进程三大类功能共41个分支。KEGG通路分析表明，10 846个高表达基因参与了5类生化代谢通路。筛选到具有完整开放阅读框的消化酶基因17个[5个胰蛋白酶(trypsin, TRY)基因、3个氨肽酶(aminopeptidase, APN)基因和9个羧肽酶(carboxypeptidase, CP)基因]和解毒酶基因32个[11个谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase, GST)基因、13个细胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)基因和8个羧酸脂酶(carboxylesterase, CarE)基因]。系统发育分析结果表明，梨小食心虫的消化酶同源聚类分支较为分散，GSTs和CYP450s分支聚类较为集中，但都至少与1个鳞翅目昆虫同源蛋白聚在一支。qRT-PCR验证结果表明，消化酶和解毒酶基因在不同龄期梨小食心虫幼虫中肠中的表达量差异显著，表达量均在4龄幼虫期最高。【结论】本研究成功筛选和验证部分梨小食心虫幼虫中肠中高表达的消化酶和解毒酶基因，明确其与鳞翅目其他昆虫同源蛋白的进化关系。研究结果为鳞翅目其他近缘昆虫的转录组分析和以肠道为靶标的害虫防治提供了参考。

摘要: 【目的】克隆梨小食心虫Grapholitha molesta(Busck)几丁质合成酶1基因,分析该基因的分子特征及时空表达模式,为探析其生理功能奠定基础。【方法】利用简并引物和RACE技术从梨小食心虫5龄幼虫和蛹中克隆几丁质合成酶1基因的全长c DNA序列,同时获得其两个可变剪切外显子序列,并用邻接法(neighbor-joining method)与其他昆虫同源序列构建系统进化树。利用RTq PCR技术研究该基因及两个可变剪切外显子在1日龄预蛹不同组织(头、体壁、脂肪体、中肠、气管和马氏管)中以及不同发育阶段(2-5龄幼虫、预蛹、蛹和成虫)的表达特性。【结果】克隆获得梨小食心虫几丁质合成酶1基因,将其命名为Gm CHS1,该基因编码1 565个氨基酸,包含了16个跨膜螺旋,两个可变剪切外显子包含177个碱基,编码59个氨基酸序列,分别命名为Gm CHS1a(Gen Bank登录号:MF000781)和Gm CHS1b(Gen Bank登录号:MF000782)。系统发育树同源分析结果表明,Gm CHS1属于几丁质合成酶1,Gm CHS1a和Gm CHS1b分别归属于可变剪切外显子CHS1a和CHS1b。组织表达模式表明,Gm CHS1基因在体壁中表达量最高,其次是在头和气管中,其余组织中表达量较低或不表达;发育表达模式表明,该基因在各个发育阶段均有表达,幼虫蜕皮期、预蛹-蛹和蛹-成虫转变过程中表达量上调。Gm CHS1a在体壁和头部的表达量高于Gm CHS1b,而在气管和脂肪体中的表达量略低于Gm CHS1b,两者在中肠和马氏管中表达量都很低。在梨小食心虫不同发育阶段,Gm CHS1a的表达趋势表现为在幼虫蜕皮和预蛹-蛹转变过程中高表达;Gm CHS1b在幼虫各个阶段表达量都较低,在预蛹-蛹和蛹-成虫转变过程中高表达。【结论】Gm CHS1a和Gm CHS1b属于昆虫几丁质合成酶1家族,其基因在梨小食心虫不同组织及发育阶段的表达量显著不同,推测其在梨小食心虫发育过程中发挥着不同的作用。本研究为进一步探索该基因在梨小食心虫体内的功能奠定了基础。

摘要: 【目的】本研究旨在明确湿度变化对梨小食心虫Grapholitha molesta(Busck)在果实外各阶段存活率和蛀果率的影响及湿度对害虫最终存活率产生影响的关键阶段。【方法】在室内相对湿度25%,40%,55%,70%和85%条件下,记录和分析梨小食心虫的产卵量、卵孵化率、幼虫蛀果率、老熟幼虫化蛹率、蛹羽化率以及产卵、化蛹和羽化时间。【结果】湿度高低对化蛹率没有影响,供试的5种相对湿度下,化蛹率均为100%;但湿度对产卵量、卵孵化率、幼虫蛀果率、蛹羽化率和世代存活率均有显著影响,湿度越高,各阶段存活率、幼虫蛀果率和世代存活率也越高。不同虫态存活对湿度要求从高到低依次为:幼虫蛀果期>成虫期>卵期>蛹期>老熟幼虫期。湿度对害虫世代存活率产生显著影响主要发生在幼虫蛀果期、成虫期和卵孵化期。同时,湿度提高利于成虫产卵、化蛹和羽化,反之发育延缓。【结论】湿度会显著影响梨小食心虫各阶段的存活率、幼虫蛀果率和繁殖,成虫盛发期、卵期和蛀果期的湿度影响害虫种群数量和蛀果率的关键阶段。

摘要: 【目的】梨小食心虫Grapholitha molesta(Busck)是一种危害极其严重的果树害虫。中肠蛋白酶在昆虫生长发育过程中起着重要作用。本研究测定梨小食心虫幼虫中肠内蛋白酶活性的最适p H、蛋白酶抑制剂和激活剂对蛋白酶活性的作用,为利用蛋白酶抑制剂防治该害虫提供新思路。【方法】提取梨小食心虫3龄幼虫中肠液,利用酶专性底物测定各蛋白酶在3种不同缓冲溶液中的最适p H(dd H2O为对照)、蛋白酶抑制剂和激活剂对中肠蛋白酶活性的影响,同时测定饲喂蛋白酶抑制剂(PMSF,TLCK,TPCL和STI)后梨小食心虫中肠蛋白酶活性的变化。【结果】梨小食心虫幼虫中肠总蛋白酶在Tris-HCl,KH2PO4/Na OH和Glycine/Na OH 3种缓冲液中最适p H分别为10.5,11.0和11.0,强碱性胰蛋白酶的最适p H分别为10.5,11.0和11.0,弱碱性胰蛋白酶的最适p H分别为8.5,9.0和9.0,胰凝乳蛋白酶的最适p H分别为8.5,9.0和9.5。5种蛋白酶抑制剂(DTT,PMSF,TLCK,TPCL和STI)中,除TLCK对凝乳蛋白酶激活外,其他蛋白酶抑制剂对4种蛋白酶均表现为抑制,且浓度越大抑制效应越明显。抑制剂DTT对总蛋白酶和弱碱性胰蛋白酶的抑制效果高于其他抑制剂。4种蛋白酶激活剂(Mg Cl2,Ca Cl2,EDTA和EGTA)中,Mg Cl2抑制总蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性,而激活胰蛋白酶活性;Ca Cl2激活总蛋白酶和弱碱性胰蛋白酶活性,而抑制强碱性胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶,EDTA对4种蛋白酶均表现为抑制,EGTA除对强碱性胰蛋白酶表现为激活外,对另外3种蛋白酶表现抑制。用蛋白酶抑制剂PMSF,TLCK,TPCL和STI饲喂梨小食心虫幼虫,各抑制剂均可抑制4种蛋白酶活性,且在不同取样时间抑制水平不同。其中STI(50μg/m L)对4种蛋白酶的抑制效果高于其他抑制剂,且浓度越大抑制效应越明显。10,20和50μg/m L STI 3种浓度处理组,在取食后4 h时,4种蛋白酶活性升高,且上升程度与STI浓度有关;酶活性在20μg/m L STI处理后48 h,50μg/m L STI处理后60 h时最低,抑制剂STI表现出持效性。【结论】蛋白酶抑制剂对梨小食心虫幼虫中肠蛋白消化酶的活性具有一定的抑制作用,其中大豆胰蛋白酶抑制剂STI在害虫防治中具有极其重要的应用价值。

摘要: 【目的】本文旨在明确营养状况不同造成的梨小食心虫Grapholitha molesta(Busck)雌、雄蛹重量差异对其羽化的成虫产卵量、产卵期、寿命及下一代(F1)幼虫发育的影响。【方法】室内条件下,通过不同的饲养方法,获得个体重量不同的梨小食心虫雌、雄蛹,待其羽化交配后,记录其产卵量、产卵时间和成虫寿命;卵孵化前后,分别测量卵和初孵幼虫大小,计算卵孵化率,统计幼虫发育历期。【结果】雌蛹重量对梨小食心虫的成虫产卵量影响显著,其重量与产卵量呈正相关(y=15.505x-59.292);同一条件下,雌蛹与雄蛹重量也呈正相关(y=0.823x-0.538)。同时,雌蛹重量对成虫产卵期影响也较大,蛹重大的个体羽化的雌虫比蛹重小的个体羽化的雌虫产卵高峰期提前1 d;较重、中等和较轻蛹羽化出的雌虫个体每天产卵量高于10粒/雌的时间分别为910,7和56 d;产卵量高于5粒/雌的时间分别为1213,9和67 d。而雄蛹重量对产卵量、雄成虫寿命影响没有明显影响。较轻的蛹羽化的雌成虫寿命比较重蛹羽化的雌成虫短23 d;而雄蛹重量对其羽化的雄成虫寿命影响没有明显规律。雌、雄蛹重量对其羽化成虫的卵孵化率、卵和初孵幼虫的大小影响均不显著,对F_1幼虫发育历期影响也不显著。【结论】梨小食心虫雌蛹重对羽化成虫的产卵量和产卵期等影响显著,田间防治时应注意在不同条件下完成发育的个体,尤其是雌虫,由于营养差异引起的个体大小对随后种群增长的影响。