摘要: 烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)在昆虫中枢神经系统的递质传递过程中起着重要作用。本研究采用RT-PCR和RACE技术,从桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)体内克隆获得nAChRβ亚基的cDNA序列,命名为Bdβ3(GenBank登录号:JF974074)。测序结果表明,Bdβ3的cDNA序列全长1602bp,开放阅读框为1287bp,编码429个氨基酸残基,预测蛋白质分子量和等电点分别为48.8ku和5.81。通过对氨基酸同源性分析表明,Bdβ3具有nAChR亚基的典型特征,与其他昆虫nAChR亚基具有较高的氨基酸相似性,与黑腹果蝇nAChRβ3亚基具有49.78%的相似性。Bdβ3在桔小实蝇的不同发育时期和成虫的不同体段的实时定量PCR结果表明,Bdβ3在整个发育阶段均有表达,其中在成虫期的表达水平最高,这可能与Bdβ3主要在成虫期发挥作用有关;Bdβ3在桔小实蝇头部表达量最高,显著高于胸部和腹部。研究结果为深入分析桔小实蝇nAChR亚基的功能以及对多杀菌素的靶标抗性机制提供了基础数据。

摘要: 【目的】为探究肽聚糖识别蛋白(PGRP)基因BdPGRP-SB1在桔小实蝇Bactrocera dorsalis免疫中的作用。【方法】本研究利用PCR克隆桔小实蝇BdPGRP-SB1全长cDNA序列;利用生物信息学软件对该基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列特征进行分析。采用RT-qPCR分析BdPGRPSB1在桔小实蝇不同发育阶段(卵、幼虫、蛹、成虫)及5日龄成虫不同组织(中肠、马氏管、后肠、脂肪体、卵巢和精巢)中的表达模式;对桔小实蝇5日龄雌成虫分别注射大肠杆菌Escherichia coli0111:B4肽聚糖(PGN-EB)和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus肽聚糖(PGN-SA)后检测BdPGRP-SB1表达水平变化。利用RNAi沉默BdPGRP-SB1的表达,测定大肠杆菌和金黄色葡萄球菌诱导后桔小实蝇雌成虫的死亡率及大肠杆菌诱导后抗菌肽(AMP)基因attacin-A,defensin和diptercin表达变化情况。【结果】克隆获得桔小实蝇BdPGRP-SB1的全长cDNA序列(GenBank登录号:MN892482),开放阅读框长558 bp,编码185个氨基酸,其编码蛋白预测分子量为21.45 kD,等电点为8.57。序列分析表明,BdPGRP-SB1无跨膜结构域,具有PGRP保守结构域,前端具有信号肽,为分泌型蛋白;具有Zn(2+)依赖性酰胺酶活性和DAP型肽聚糖识别位点。系统进化分析发现,BdPGRP-SB1与辣椒实蝇B.latifrons的PGRP-SB1亲缘关系最近,氨基酸序列一致性达96%。发育表达模式表明,BdPGRP-SB1在桔小实蝇3日龄幼虫和成虫期高表达;组织表达谱结果显示BdPGRP-SB1在5日龄成虫各组织中均有表达,在脂肪体内表达量最高。PGN-EB和PGN-SA均能诱导桔小实蝇雌成虫体内BdPGRP-SB1表达水平变化。通过RNAi抑制BdPGRP-SB1表达后,注射大肠杆菌导致桔小实蝇雌成虫死亡率显著升高,以及attacin-A,defensin和diptercin表达量显著上调。【结论】结果说明桔小实蝇BdPGRP-SB1参与识别革兰氏阴性细菌,并可能参与桔小实蝇Imd途径调控其免疫反应。

摘要: 【目的】fruitless(fru)是昆虫求偶和交配行为中的关键基因,但是其在桔小实蝇Bactrocera dorsalis中的具体功能尚不清楚。本研究旨在明确fru在桔小实蝇求偶交配行为中的作用,进一步明确fru的生物学意义。【方法】根据NCBI上桔小实蝇fru的预测序列设计两端引物,以桔小实蝇羽化10 d已交配的成虫头部cDNA为模板克隆fru基因的全长cDNA,并对其编码蛋白的结构域进行预测。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测该基因在桔小实蝇交配前后表达量的变化。待合成fru基因的dsRNA后,注射到羽化9 d后的桔小实蝇雄成虫腹部进行RNAi,分别于注射后48 h和72 h取样,检测fru基因的相对表达量;并于RNAi后72 h进行求偶交配行为观察,测定桔小实蝇的交配频率和交配持续时间。【结果】克隆获得桔小实蝇fru的全长cDNA,长2 865 bp,编码954个氨基酸,预测蛋白分子量104.1 kD,等点为6.01。该基因所编码的蛋白具有特殊结构域,分别为一个BTB (Broad-complex, Tramtrack and Bric-a-bric)结构域和两个锌指(zinc finger)结构域。RT-qPCR结果表明,相比未交配的桔小实蝇成虫,fru基因在雄成虫头部中的表达量在与雌成虫交配后显著上升。相对于空白对照组(注射DEPC水)和阴性对照组(注射dsGFP),注射dsfru的RNAi处理组的雄性求偶时间延长(延长了2535 min),且交配频率下降(降低了17%22%),说明fru基因在雄性桔小实蝇的求偶交配行为中发挥着重要作用。【结论】本研究结果为明确fru在非模式昆虫桔小实蝇求偶交配行为中的功能提供参考,并为深入研究桔小实蝇的求偶交配行为和绿色防控提供了理论基础。

摘要: 【目的】脂动激素(adipokinetic hormone, AKH)是一种对昆虫正常生命活动发挥重要调控作用的神经肽，通过解析脂动激素对桔小实蝇Bactrocera dorsalis幼虫生长发育的调控作用，有助于加深对昆虫神经肽保守性及功能多样性的认识，同时也为评估AKH信号系统作为新型控制剂靶标潜力提供基础依据。【方法】克隆桔小实蝇AKH基因BdAKH的cDNA全长序列，利用生物信息学方法分析其序列特征；采用qPCR技术检测BdAKH在桔小实蝇不同发育阶段(卵、1-3龄幼虫、蛹以及未交配雌成虫和雄成虫)和桔小实蝇3龄末期幼虫不同组织(中枢神经系统、心侧体/咽侧体(corpora cardiaca/corpus allatum, CC/CA)、脂肪体、马氏管、中肠、后肠、表皮、卵巢、精巢以及血淋巴)中的表达量；运用免疫组化技术定位桔小实蝇3龄幼虫中表达BdAKH的神经元；通过RNAi结合生物学观察分析BdAKH对桔小实蝇幼虫生长发育的调控作用。【结果】克隆获得桔小实蝇BdAKH(GenBank登录号：KY073319) cDNA全长序列，长572 bp,开放阅读框长252 bp,编码83个氨基酸残基。桔小实蝇BdAKH结构相对保守，包含一个成熟肽序列QLTFSPDWamide; BdAKH基因在桔小实蝇成虫中表达量较高，并且主要在3龄末期幼虫CC/CA表达；敲低3龄幼虫BdAKH后导致桔小实蝇化蛹时间和化蛹率较对照组(dsGFP)分别延迟和降低，但蛹重及蛹型较对照组之间无明显差异。【结论】AKH对桔小实蝇幼虫生长发育过程具有重要调控作用，表明其具备作为害虫控制剂靶标的潜力。

摘要: 【目的】利用表皮碳氢化合物进行昆虫鉴定是目前昆虫分类学中非常活跃的研究方向之一。昆虫表皮碳氢化合物的液体浸提及进样技术是GC-MS常规的进样方法之一,随着现代技术的发展,固体进样也被广泛地用于昆虫表皮碳氢化合物的鉴定及昆虫的分类与进化分析。本研究探索利用固体进样法开展实蝇表皮碳氢化合物的提取与分析,探索并获得简便可行的取样与进样技术,为检疫性实蝇的快速鉴定提供新方法。【方法】以桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)成虫为材料,采用固体进样与液体浸提进样方法,开展实蝇表皮碳氢化合物组成成分鉴定与分析;比较获得桔小实蝇成虫取样部位,并分析标本保存时间对桔小实蝇表皮碳氢化合物组成的影响。【结果】利用固体进样技术获得的桔小实蝇翅表皮碳氢化合物种类(39)较液体进样的(36)略多,且翅和中足的表皮碳氢化合物含量分别为0.1823.37和0.034.13 ng/μg,极显著地高于用液体进样法检测到相同部位的化合物含量(分别为0.053.93和0.010.68 ng/μg)(P<0.01),而且前者的检测灵敏度是后者的1.710.8倍;同时,翅样品的表皮碳氢化合物含量显著地高于足中的含量(P<0.01)。利用固体进样获得的桔小实蝇成虫翅、足或胸部的表皮碳氢化合物图谱与对照处理所得图谱相似。干燥保存30 d的桔小实蝇翅的碳氢化合物的种类及含量与新鲜标本(保存0 d)无显著性差异(P>0.05);但保存30,60和150 d标本的碳氢化合物存在显著差异(P<0.05),主要是含量的差异。【结论】研究表明,利用固体进样检测昆虫表皮碳氢化合物的灵敏度较高,而且桔小实蝇成虫的主要表皮碳氢化合物种类较稳定,因此可以作为我国口岸检疫性实蝇表皮碳氢化合物获取与分析的一种新方法,而且检测中翅是固体进样的较合适取样部位。