摘要: 【目的】在活体水平验证飞蝗Locusta migratoria羧酸酯酶基因LmCesA1和LmCesA2是否参与有机磷杀虫剂的代谢解毒。【方法】采用Gal4/UAS系统,借助转基因技术,构建两个转基因黑腹果蝇Drosophila melanogaster品系,选取3品系Gal4(act-Gal4, tub-Gal4和c601-Gal4)果蝇作为母本分别与两种转基因果蝇(UAS-LmCesA1和UAS-LmCesA2)以及一种亲本对照果蝇(RB0006{y v; attP40, y+})进行杂交。对子一代转基因果蝇从DNA和RNA水平进行验证,筛选出成功构建的品系。采用生物测定方法检测转基因果蝇与Gal4果蝇杂交后代对马拉硫磷的抗性。【结果】转基因果蝇DNA水平鉴定结果显示,转基因果蝇tub>LmCesA1和tub>LmCesA2中分别扩增到目的基因LmCesA1和LmCesA2,而对照组果蝇tub>attP40中未扩增到目的基因。转基因果蝇RNA水平的检测结果显示,这两个基因在相应的杂交后代中均有表达,表明转基因果蝇构建成功。目的基因在转基因果蝇成虫不同组织中的表达结果表明,两个目的基因LmCesA1和LmCesA2分别在转基因果蝇c601>LmCesA1和c601>LmCesA2的肠道中高表达;LmCesA1在c601>LmCesA1果蝇肠道中的表达量分别是脑和表皮中的7.6和16.7倍,LmCesA2在c601>LmCesA2果蝇肠道中的表达量分别是脑和表皮中的5.4和10.9倍。杀虫剂生物测定结果显示,与对照组果蝇(c601>attP40)相比,超表达LmCesA2的果蝇(c601>LmCesA2)对马拉硫磷的抗性显著提高,抗性倍数为1.67。【结论】本研究的结论与我们前期采用RNAi结合杀虫剂生测的研究结论一致,即羧酸酯酶基因LmCesA2可能参与飞蝗对马拉硫磷的代谢解毒过程。

摘要: 【目的】明确弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundi和产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca两种肠道共生细菌对斑翅果蝇Drosophila suzukii生长发育和物质代谢的影响。【方法】以正常饲养条件下的斑翅果蝇、构建的斑翅果蝇无菌品系以及弗氏柠檬酸杆菌和产酸克雷伯氏菌单一共生菌感染的斑翅果蝇品系为材料,检测不同品系间斑翅果蝇的卵孵化率、3龄幼虫体重和化蛹率;测定不同斑翅果蝇品系3龄幼虫体内蛋白质、氨基酸、糖原和游离脂肪酸等代谢物的含量及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活力。【结果】正常饲养条件下的斑翅果蝇卵孵化率、3龄幼虫体重、化蛹率及3龄幼虫体内蛋白质的含量均高于其他斑翅果蝇品系,且无菌品系中的最低。弗氏柠檬酸杆菌和产酸克雷伯氏菌感染的斑翅果蝇品系3龄幼虫中的氨基酸和糖原含量均低于斑翅果蝇无菌品系和正常品系。弗氏柠檬酸杆菌感染斑翅果蝇品系3龄幼虫体内游离脂肪酸的含量较其他品系的也降到最低。弗氏柠檬酸杆菌和产酸克雷伯氏菌感染斑翅果蝇品系3龄幼虫体内POD活力显著高于无菌品系和正常品系,而CAT活力显著低于无菌品系。【结论】斑翅果蝇肠道中无肠道共生细菌时生长发育迟缓,在食物中分别添加弗氏柠檬酸杆菌和产酸克雷伯氏菌后可一定程度上促进斑翅果蝇的发育,这与添加肠道共生菌后斑翅果蝇体内代谢物的变化密切相关。

摘要: 【目的】研究黑腹果蝇Drosophila melanogaster对短小乳杆菌Lactobacillus brevis有氧与无氧代谢产物的产卵选择,并解析这些代谢产物影响果蝇产卵行为的机制和生物学意义。【方法】应用产卵双选择装置,检测成年雌果蝇产卵的选择行为;利用黑暗条件(暗盒)、嗅觉突变体和摘除前足味觉感受器的方式探究介导该行为的感觉系统;通过在不同浓度乳酸(0, 70, 280 mmol/L)的培养基上培养黑腹果蝇,探究乳酸对其后代的发育历期和存活率的影响;利用免疫荧光染色法检测乳酸对果蝇肠道上皮细胞增殖情况的影响。【结果】短小乳杆菌无氧代谢产物引起成年雌性黑腹果蝇产卵避性,产卵指数为-0.47;短小乳杆菌有氧代谢产物乳酸含量为0.4 mmol/L,无氧代谢产物乳酸含量为126.8 mmol/L;雌性果蝇对乳酸同样产生产卵避性反应,且产卵避性随乳酸浓度的增高而增强。切除前足的果蝇对乳酸的产卵避性显著降低。与对照相比, 70 mmol/L的乳酸使幼虫的成蛹时间和成虫羽化时间分别延长了1.42 d和1.17 d,存活率降低了36.0%。乳酸明显破坏肠道上皮的完整性,促进肠道上皮细胞的增殖。【结论】短小乳杆菌无氧代谢产物引起成年果蝇产卵避性。果蝇主要通过味觉感知短小乳杆菌无氧代谢产物乳酸,这引起果蝇产卵避性,从而提高后代的生长发育和幼虫的存活率。

摘要: 【目的】灵活操控靶基因的表达水平对于研究基因的功能十分重要。Gal4/UAS系统已被广泛应用于调控基因表达,可研究果蝇Drosophila等模式生物复杂的生物学问题。受采用载体的特性及插入位点的影响,Gal4或UAS转基因品系在构建好之后,其调控靶基因的能力基本是确定的。本研究旨在在现有Gal4/UAS系统的基础上,开发一种新的策略,实现在果蝇翅芽中灵活操控wingless(wg)基因的表达水平。【方法】用遗传学手段将黑腹果蝇Drosophila melanogaster品系的UAS-wg和UAS-wg-RNAi转基因重组到同一黑腹果蝇品系中。将该重组黑腹果蝇品系与dpp-Gal4黑腹果蝇品系杂交,同时驱动UAS-wg和UAS-wg-RNAi在果蝇幼虫翅芽中共表达。杂交子代幼虫分别放置在不同的温度(18, 25和30℃)下培养。将幼虫翅芽解剖并进行免疫组化染色,测量染色的荧光强度,分析翅芽中wg的表达水平。【结果】在低温(18℃)下,UAS-wg在基因表达调控中起主要作用,wg表现为超表达,但其超表达的效率可被UAS-wg-RNAi有效地削弱。相反,在高温(30℃)下,UAS-wg-RNAi起主导作用,wg的表达受到抑制。并且通过转换温度,可实现wg在翅芽发育的不同阶段在超表达和抑制之间相互转化,从而灵活地操控wg基因在翅芽中的表达水平。【结论】该方法可以灵活操控果蝇翅芽中wg基因的表达水平,对于调控转基因的表达有重要的意义。

摘要: 非编码RNA(ncRNA)是生物体细胞内一类重要的调控分子,其介导的昼夜节律调控日益受到研究者的重视。本文主要以黑腹果蝇Drosophila melanogaster和哺乳动物的相关研究为背景,阐述了微小RNA(miRNA)和长链非编码RNA(lncRNA)对昼夜节律的调控。miRNA介导的昼夜节律调控包括:生物体内(尤其是钟神经元中)具有节律性表达的miRNA;输入系统和miRNA存在相互调控,这主要是通过光照这个授时因子起作用;miRNA可直接调控核心振荡器,还可以调控其他基因而间接影响到核心振荡器;miRNA对输出系统的调控主要集中在代谢取食节律、运动节律、睡眠节律等。昼夜节律可调控lncRNA的表达,同时lncRNA也可调控昼夜节律,且lncRNA对基因调控范围广,作用机制复杂,这些都具有广阔的研究前景。本文将有助于进一步深入研究ncRNA对昼夜节律的调控。