摘要: 【目的】结合四臂嗅觉仪与轨迹跟踪分析系统,通过分析不同试验条件下黑腹果蝇Drosophila melanogaster的嗅觉行为,建立适合于果蝇等小型昆虫的嗅觉行为实验技术体系。【方法】采用Ethovision XT软件追踪黑腹果蝇在四臂嗅觉仪内的活动轨迹,分析各区域内的累计停留时长、运动速度;同时,考察气流速度和味源设置对苹果醋引诱及蓝桉Eucalyptus globulus叶油驱避黑腹果蝇效果的影响。【结果】适合于黑腹果蝇嗅觉行为分析的气流速度为3001 200 mL/min; 300 mL/min时黑腹果蝇个体间运动速度最为均一,因此推荐最适气流速度大小为300 mL/min。味源设置不会改变黑腹果蝇对味源物的嗅觉行为反应,但对味源物的引诱指数有一定的影响,单一臂放置味源物试验效果更佳。单头测试的实验效果优于多头试验。【结论】本研究建立的基于轨迹跟踪的嗅觉行为分析体系可用于昆虫信息化合物有效成分的筛选鉴定。在合适的气流条件下,单一臂设置味源化合物逐头进行测试试验效果更佳;多头试验可用于化合物的初步筛选。

摘要: 【目的】通过检测黑腹果蝇Drosophila melanogaster中piggyBac(PB)转座子AgoPLE1.1的转化活性,明确AgoPLE1.1开发为昆虫转基因载体的潜力。【方法】构建AgoPLE1.1转座酶辅助质粒pAgoHsp和带有红色荧光标记的供体质粒pXLAgo-PUbDsRed,辅助质粒和供体质粒以170 ng/μL∶400 ng/μL, 90 ng/μL∶200 ng/μL和90 ng/μL∶100 ng/μL 3种不同的比例混合后分别注射新鲜的W(1118)黑腹果蝇胚胎,筛选注射后代中的转基因黑腹果蝇个体;利用Southern杂交验证转基因黑腹果蝇中AgoPLE1.1转座子的插入拷贝数;利用染色体步移技术克隆AgoPLE1.1插入位点旁侧序列,明确AgoPLE1.1转座子的转座特征。【结果】AgoPLE1.1转座子在黑腹果蝇中具有转化活性,转基因频率为1.32%1.94%。Southern杂交结果显示,AgoPLE1.1转座子在黑腹果蝇中至少有6个插入位点。染色体步移法克隆了其中4个位点,分别位于黑腹果蝇的3R, 3L, 2L和X染色体,并且AgoPLE1.1转座子在黑腹果蝇染色体中的整合带有供体质粒的骨架。【结论】PB转座子AgoPLE1.1仅可以在黑腹果蝇中以较低的频率进行非精确的剪切和转座,不具有开发为新型昆虫转基因载体的潜力。

摘要: 【目的】利用CRISPR/Cas9基因敲除系统在黑腹果蝇Drosophila melanogaster细胞中筛选并检测组蛋白甲基化修饰对蜕皮激素20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)信号传导的调控。【方法】通过Flybase网站分析并总结黑腹果蝇组蛋白甲基转移酶及其修饰位点;将5个组蛋白甲基转移酶基因[trr,Mes-4,ash1,Su(var)3-9和egg]的sgRNA插入到敲除载体pAc-sgRNA-Cas9骨架中并转染黑腹果蝇Kc细胞,利用TA克隆和测序鉴定突变位点。以Trr正调控20E初级应答基因Br-C的转录表达为阳性对照,利用qRT-PCR和Western blot检测该系统敲除靶基因的有效性;通过检测20E应答元件(20E response element, EcRE)双荧光素酶活性确定trr,Mes-4,ash1,Su(var)3-9和egg是否参与20E信号传导。【结果】果蝇组蛋白甲基化修饰主要发生在组蛋白H3的赖氨酸残基上,H3的精氨酸残基和组蛋白H4的甲基化修饰较少。trr敲除载体pAc-trr-sgRNA-Cas9转染Kc细胞后成功突变trr,降低H3K4三甲基化水平并阻断20E对其初级应答基因Br-C的转录诱导,证明该敲除系统的有效性。除trr之外,Mes-4和egg的敲除降低EcRE的双荧光素酶活性。【结论】插入靶标基因sgRNA序列的pAc-sgRNA-Cas9敲除载体在果蝇Kc细胞中可以有效快捷地突变靶基因。利用该敲除系统发现,除Trr之外,Mes-4和egg影响EcRE的活性而参与20E信号传导。本研究为昆虫细胞CRISPR/Cas9介导的基因敲除和组蛋白甲基化修饰调控20E信号传导的深入研究提供了理论依据与工作基础。

摘要: 【目的】肠道微生物在宿主的多种生命活动中发挥重要作用。本研究旨在通过研究植物乳杆菌Lactobacillus plantarum,苹果醋酸杆菌Acetobacter malorum和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 3种微生物对黑腹果蝇Drosophila melanogaster觅食、产卵和发育的影响,进一步阐明肠道微生物与宿主的互作调控机制。【方法】采用引诱实验检测体外培养的植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌和酿酒酵母对交配前后黑腹果蝇成虫的引诱力以及这3种微生物的单一微生物和其中2种或3种微生物的混合物对非处女蝇的引诱力。采用产卵选择实验检测黑腹果蝇非处女蝇对单一微生物和其中2种或3种微生物的混合物的产卵偏好。将黑腹果蝇卵在接种分别含有植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌和酿酒酵母的培养基和正常培养基(对照)上培养,测量幼虫体重;同时将卵在分别含有活菌或灭活的这3种单一微生物的培养基上和正常培养基上培养,统计化蛹数,以检测不同微生物对黑腹果蝇幼虫发育的影响。将黑腹果蝇幼虫在分别含有植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌和酿酒酵母的培养基及正常培养基中培养72 h, qRT-PCR检测胰岛素信号通路的关键基因InR在黑腹果蝇幼虫中的相对表达量变化。【结果】苹果醋酸杆菌主要影响黑腹果蝇的产卵,酿酒酵母和植物乳杆菌则可同时影响黑腹果蝇觅食和产卵,且与单一微生物相比,非处女黑腹果蝇更趋向于含有2种或3种微生物的混合物。产卵选择实验表明,3种单一供试微生物及其中2种或3种微生物的混合物对黑腹果蝇的产卵选择具有显著的吸引力,其中混合物的影响最大,然后依次是苹果醋酸杆菌、酿酒酵母、植物乳杆菌。3种微生物均可促进黑腹果蝇幼虫的发育,活菌在接种早期加快幼虫到蛹的发育,灭活菌的促进作用则相对滞后。与对照比较,InR在接种苹果醋酸杆菌的培养基上培养的黑腹果蝇幼虫中的表达量显著降低,而在分别接种植物乳杆菌和酿酒酵母的培养基上培养的幼虫中则被显著促进表达。【结论】苹果醋酸杆菌可引诱黑腹果蝇的产卵,酿酒酵母和植物乳杆菌对黑腹果蝇的觅食和产卵都有具有引诱力;同时微生物的多样性可增加黑腹果蝇的觅食和产卵偏好。植物乳杆菌、苹果醋酸杆菌和酿酒酵母可能通过不同的调控机制影响黑腹果蝇幼虫的生长发育。

摘要: 【目的】果蝇Dichaete基因是Sox家族B亚家族基因,其表达贯穿整个胚胎发育阶段,在个体发育过程中发挥重要作用。Dichaete在野生型果蝇幼虫足芽上也有微弱表达,然而其在足发育过程中的作用少有报道。本研究旨在研究异位表达Dichaete对果蝇足部形态构成的影响,探索相关的作用机制。【方法】黑腹果蝇Drosophila melanogaster en-Gal4品系雄性成虫与UAS-Dichaete转基因品系处女蝇杂交,驱动Dichaete异位表达,解剖子一代成虫足,在显微镜下观察异位表达的Dichaete对成虫足形态结构的影响;同时采用免疫组化技术检测异位表达Dichaete对果蝇足芽细胞凋亡和Distal-less(Dll)表达的影响。【结果】异位表达Dichaete导致黑腹果蝇成虫足末端结构缺陷,引起3龄幼虫足芽细胞凋亡增加,上调了Distal-less基因的表达,但对Wg和Dpp信号均无影响;抑制细胞凋亡也无法拯救该缺陷。【结论】异位表达Dichaete导致黑腹果蝇成虫足末端结构缺陷,Dichaete可能通过上调Distal-less基因影响足部发育。